一測多評法同時測定枇杷葉標準湯劑中3種綠原酸

李文兵， 邢 冷， 盧君蓉， 許 玲， 姜艷嬌， 劉 圓， 胡昌江3,*

(1.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川 成都 610225；3.國家中醫藥管理局“中藥配方顆粒質量與臨床療效評價”重點研究室，四川 成都 611900；4.四川新綠色藥業科技發展有限公司，四川 成都 611900；5.成都中醫藥大學，四川 成都 611137；6.西南民族大學民族醫藥研究院，四川 成都 610041)

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的干燥葉，是中醫臨床常用的一味中藥，具有清肺止咳，降逆止嘔之功效，臨床上常用于肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴等癥的治療[1]。現代研究表明，枇杷葉有止咳[2]、祛痰[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗腎衰竭[6]等藥理作用，其主要成分為三萜[7-8]、揮發油[9]、倍半萜[10]、黃酮[11]等。

枇杷葉在中醫臨床上多入湯劑，而2020年版《中國藥典》對其質量控制指標為三萜類(齊墩果酸和熊果酸)，由于該類成分極性較小，在湯劑中難以溶出和檢測。國家藥典委員會公示第一批中藥配方顆粒標準中，基于檢測成本的考慮，枇杷葉配方顆粒僅以綠原酸單一成分作為質控指標，導致其專屬性不強，難以全面控制產品質量。因此，本文以綠原酸為參照物，建立枇杷葉標準湯劑中一測多評方法，同時測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量，不僅可以降低檢測成本，還能實現多成分同時檢測，增加專屬性，可為枇杷葉標準湯劑及配方顆粒標準提升和修訂提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；Waters 2695-2996高效液相色譜儀(美國Waters公司)；XP26型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ5200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；1810A摩爾原子型超純水器(上海摩勒科學儀器有限公司)；NCCO-300型全自動切藥機(杭州金竺機械有限公司)；全自動分體式陶瓷煎藥壺(潮州市永達基電器廠)；LGJ-100F型真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號110753-201415，純度96.2%，中國食品藥品檢定研究院)；新綠原酸(批號17062003，純度98%)、隱綠原酸(批號17061401，純度98%)對照品(成都普菲德生物技術有限公司)。枇杷葉20批，產地四川簡陽(3批)、金堂(4批)、仁壽(8批)、中江(1批)(批號BT01～BT16)，浙江紹興、麗水(各1批)(批號BT17～BT18)，福建南平(2批)(批號BT19～BT20)，經專家鑒定為正品，按照2020年版《中國藥典》規定除去絨毛，用水噴潤，切絲，干燥。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent 5 HC C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.4%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，95%A；5～35 min，95%～78%A；35～50 min，78%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長327 nm；進樣量10 μL。在此條件下，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸色譜峰與樣品中其他組分色譜峰達到基線分離，理論塔板數均大于5 000，見圖1。

1.新綠原酸 2. 綠原酸 3. 隱綠原酸圖1 各綠原酸HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸對照品適量，置于量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，質量濃度分別為1.077 2、0.581 5、0.348 1 mg/mL，精密量取適量，置于量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，即得(含綠原酸0.430 9、0.172 4、0.068 9、0.027 6、0.011 0 mg/mL，新綠原酸0.232 6、0.093 0、0.037 2、0.014 9、0.006 0 mg/mL，隱綠原酸0.139 2、0.055 7、0.022 3、0.008 9、0.003 6 mg/mL)。

2.3 標準湯劑制備 取飲片適量，按枇杷葉標準湯劑工藝制備[12]，即得。

2.4 供試品溶液制備 取標準湯劑粉末約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，密塞，稱定質量，超聲(600 W、40 kHz)處理30 min，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.5 線性關系考察 精密吸取對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各綠原酸線性關系

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下對照品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積RSD分別為0.08%、0.12%、0.09%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批本品(批號BT01)6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量RSD分別為0.78%、0.89%、1.01%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號BT01)適量，于0、1、2、4、8、16、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量RSD分別為1.24%、1.03%、1.51%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的標準湯劑(批號BT01)6份，每份0.10 g，加入1 mL對照品溶液(含綠原酸0.404 1 mg/mL、新綠原酸0.352 0 mg/mL、隱綠原酸0.503 2 mg/mL)，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各綠原酸加樣回收率試驗結果(n=6)

2.10 相對校正因子、相對保留時間測定及耐用性考察

2.10.1 相對校正因子 以綠原酸為內標，采用多點校正法[13-15]計算新綠原酸和隱綠原酸的相對校正因子、相對保留時間，結果見表3。

2.10.2 不同儀器對相對校正因子的影響 考察Agilent 1260、Shimadzu LC-20A、Waters 2695-2996色譜儀對相對校正因子的影響，結果見表4，可知均無明顯影響(RSD<3%)。

2.10.3 不同色譜柱對相對校正因子的影響 在Agilent 1260 HPLC色譜儀上，考察Agilent 5 HC、Phenomenex、Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)對相對校正因子的影響，結果見表5，可知均無明顯影響(RSD<3%)。

表3 各綠原酸相對校正因子、相對保留時間測定結果

表4 不同儀器對相對校正因子的影響(n=3)

表5 不同色譜柱對相對校正因子的影響(n=3)

2.11 樣品含量測定 取不同產地、批次標準湯劑凍干粉，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別采用外標法、一測多評法測定含量，結果見表6，可知2種方法無明顯差異，表明一測多評法具有較高的可信度。

3 討論

中藥標準湯劑是在中醫藥理論指導下，參考現代提取方法，經標準化工藝制備而成的單味或復方中藥水煎劑[16-17]，主要用于中藥新型飲片及成方制劑的工藝規范、質量控制及一致性評價等[18]。“標準湯劑”概念最早由日本提出，作為漢方藥制劑的化學和生物學基準。國內在1998年魏剛[19]首次提出中藥復方的研究應建立在標準湯劑的基礎之上，但直到2016年陳士林等[20]系統闡述中藥標準湯劑的內涵和外延，才引起相關監管部門的重視，并逐漸成為評價中藥配方顆粒及經典名方制劑工藝和質量標準是否合理的基準物質。

表6 各綠原酸含量測定結果(n=2)

2020年版《中國藥典》枇杷葉質量控制指標為熊果酸和齊墩果酸，前期對20批次枇杷葉標準湯劑中熊果酸和齊墩果酸含量進行測定，結果發現，標準湯劑中熊果酸和齊墩果酸含量極微，總量僅為0.002%～0.072%；進一步通過UPLC-Q-TOF-MS對枇杷葉標準湯劑中化學成分進行鑒定，并參照文獻[21]用標準品比對，確認含有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸等3種苯丙素類成分，且含量較高。該類成分有抗菌[22]、抗炎[23]等藥理作用，與枇杷葉清肺止咳傳統功效有一定關聯性，因此，選擇3種綠原酸類成分作為標準湯劑的含測指標，并建立一測多評含量測定方法，不僅可節約檢測成本，還能提高質量控制專屬性，可為枇杷葉標準湯劑及配方顆粒標準的修訂提供參考。