紅外光譜結合化學計量學鑒別懸鉤木主流品種

王柯入， 王成輝， 李子儀， 林 菁， 徐鑫鵬， 古 銳*

(1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137)

藏藥懸鉤木始載于藏醫學經典著作《月王藥診》[1]，來源于薔薇科懸鉤子屬多種植物，具有治療風熱病、熱性時疫的功效，特效于肺病，是藏醫治療瘟疫、感冒的要藥，《中國藥典》《中華人民共和國衛生部藥品標準(藏藥)》《藏藥標準》等[2-6]記載有25個相關制劑用于臨床。文獻調研和西藏、青海、四川3省實地調研表明，懸鉤木主流藥材基原為粉枝莓RubusbiflorusBuch.-Ham. ex Smith、紅泡刺藤RubusniveusThunb.和黑腺美飾懸鉤子Rubussubornatusvar.melanadenusFocke[7-10]。由于懸鉤木藥材是去皮去髓莖枝，鑒別特征嚴重缺失，難以通過藥材性狀鑒別基原；藏區懸鉤子屬植物品種多樣[11-13]，進一步增大了懸鉤木藥材鑒別的難度。目前，關于藏藥懸鉤木藥材基原鑒別研究甚少，大多僅通過植物性狀和粉末顯微特征，但前者不適用于藥材基原鑒別，后者不明顯而難以用于藥材鑒別。

紅外光譜檢測技術預處理簡單、檢測速度快，在不需要化學對照品的情況下，可根據紅外圖譜對樣品化學成分進行分析表征，反應樣品化學成分種類和含量的差異；結合化學計量學方法挖掘原始光譜中潛在信息，可達到品種鑒別的目的[14-17]，能體現藥材的整體性和模糊性，適合現有研究少、化學成分復雜的藥用植物研究。本研究采集了藏藥懸鉤木3個主流品種共19份樣品的紅外光譜信息，對光譜數據進行自動平滑、基線校正、坐標歸一化、二階導數求導等處理后，采用系統聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)作進一步考察，以期為該藥材鑒別提供依據。

1 材料

1.1 藥材 2019年6月至2020年9月從西藏、青海、四川、云南采集25批樣品，經重慶市中藥研究所秦松榮教授鑒定分別為粉枝莓7批、紅泡刺藤5批、黑腺美飾懸鉤子10批、弓莖懸鉤子1批、桔紅懸鉤子1批、華中懸鉤子1批，具體見表1，按照《西藏自治區藏藥材標準》[18]下炮制要求將其莖去皮去髓干燥，制成懸鉤木，粉碎后過200目篩。

1.2 儀器與試劑 Cary 600 傅里葉變換紅外光譜儀(美國Agilent公司)；FW-5新型紅外壓片機(天津博天勝達科技發展有限公司)；DZF-6050真空干燥箱 (上海精宏實驗設備有限公司)；BSA124S電子天平(德國賽多利斯公司)；FW-135萬能粉碎機 (天津泰斯特儀器有限公司)。溴化鉀(成都市科隆化學品有限公司)。

2 方法

2.1 分析條件 溫度24～26 ℃；相對濕度35%～40%；粉末壓片累積掃描次數32次；掃描范圍4 000～400 cm-1；分辨率為4 cm-1。

2.2 樣品測定 采用溴化鉀壓片法，按1∶100比例稱取適量樣品粉末至瑪瑙研缽中，與干燥的KBr充分研磨，壓制成厚度約為1 mm的透明錠片，通過傅里葉紅外變換儀測定透光率，每批樣品制備3個透明錠片，每個透明錠片掃描3次。同法制備KBr空白片。

表1 樣品信息

2.3 數據分析 通過OMINIC 8.2軟件對19批樣品的紅外光譜圖進行平滑處理、基線校正、坐標歸一化等處理，再取同一批樣品9張紅外光譜圖的平均譜圖作為紅外標準譜，對其進行二階導數處理，得到相應樣品二階導數紅外光譜圖；對各樣品紅外標準譜和二階導數紅外光譜圖進行比較，得到相似度；導出紅外標準譜和二階導數紅外光譜圖的CSV格式數據及峰位、峰強等信息，分析特征峰。基于二階導數數據，采用SPSS 19.0 軟件進行系統聚類分析(HCA)，SIMCA 14.0軟件進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取FZM-1適量，按“2.2”項下方法制備供試片，在“2.1”項條件下測定5次，測得紅外圖譜相關系數為0.999 3～0.999 6，RSD為0.03%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取FZM-1適量，按“2.2”項下方法制備供試片，置于干燥器內保存，取FZM-1適量，每隔10 min測定1次，共5次，測得紅外譜圖相關系數為0.998 4～0.999 1，RSD為0.06%，表明樣品在50 min內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取FZM-1適量，按“2.2”項下方法制備5份供試片，在“2.1”項條件下測定，測得紅外譜圖相關系數為0.993 5～0.999 4，RSD為0.33%，表明該方法重復性良好。

2.5 外部驗證試驗 取FZM-7、HP-5、HX-10和GJ、JH、HZ適量，在“2.1”項條件下測定，進行外部驗證。

3 結果

3.1 紅外光譜圖 19批樣品(FZM-1、FZM-2、FZM-3、FZM-4、FZM-5、FZM-6，HP-1、HP-2、HP-3、HP-4和HX-1、HX-2、HX-3、HX-4、HX-5、HX-6、HX-7、HX-8、HX-9)紅外光譜圖相似度高，見圖1，難以從譜線看出不同品種之間的差別。指紋圖譜主要吸收區域在3 600～3 050、3 050～2 800、1 800～1 550、1 550～1 200、1 200～900、400～900 cm-1附近，吸收峰在1 800～400 cm-1波段內較為密集；3 352 cm-1附近頻率低、譜帶寬的吸收峰推測是O-H的伸縮振動峰；2 930 cm-1附近的吸收峰推測是烷烴C-H伸縮振動峰；1 741、1 603 cm-1附近的吸收峰推測是苯環的碳骨架彎曲振動以及C≡N、C=O、C=C等伸縮振動；1 508 cm-1附近的吸收峰與1 603 cm-1成對出現，推測是苯環的伸縮振動峰；1 459 cm-1附近的吸收峰推測是C-H的面內彎曲振動峰或C-O伸縮振動峰；1 442、1 373、1 326 cm-1附近的吸收峰推測是C-H或O-H的面內彎曲振動峰；1 242 cm-1附近的吸收峰推測是取代苯類C-H或0-H面內彎曲振動峰；1 158、1 106、1 052 cm-1附近的的吸收峰推測推測是苷類、多糖類碳水化合物的C-O彎曲振動；605 cm-1附近的吸收峰推測是烯烴的C-H彎曲振動或苯環的彎曲振動和面外彎曲振動峰。

圖1 19批樣品紅外光譜圖(4 000～400 cm-1)Fig.1 Infrared spectra of nineteen batches of samples (4 000-400 cm-1)

表2顯示，3個品種的相似度為91.5%～99.5%，但在所含成分類型或含量上仍存在差異；不同批次粉枝莓、紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子之間的相似度分別為92.2%～99.4%、97.6%～99.8%、95.6%～99.9%，表明產地和批次對藥材品質有影響，以粉枝莓更明顯，與不同批次該藥材厚度質地差異大的實際情況相符合。

表2 19批樣品紅外光譜圖相似度(%)

采用OMINIC 8.2軟件對同一品種不同批次樣品紅外光譜圖進行統計，所得到的平均譜圖作為標準譜圖，見圖2，可知3個品種圖譜整體相似。其中，粉枝莓在775、3 794 cm-1處有穩定的特征峰，紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子在1 601 cm-1處有穩定的特征峰，黑腺美飾懸鉤子在1 614 cm-1處有穩定的特征峰，可初步作為3個品種的鑒別依據。

注：A～C分別為粉枝莓、紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子。圖2 3個品種紅外光譜圖(4 000～400 cm-1)Fig.2 Infrared spectra of three species (4 000-400 cm-1)

3.2 紅外二階導數光譜圖 將3個品種紅外光譜數據進行二階導數處理，得到紅外二階導數光譜圖[19]，見圖3，可知三者整體吸收區域較為相似；相似度見表3，可知為66.39%～97.99%，而不同批次粉枝莓、紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子之間的相似度分別為69.2%～98.2%、95.5%～98.5%、89.4%～99.1%，均低于“3.1”項下結果，表明二階導數處理后數據靈敏度提高。其中，粉枝莓相似度差異最大，表明其品質最不穩定，受外界因素影響最大；紅泡刺藤相似度差異最小，體現了其品質穩定的特點。

圖3 19批樣品二階導數紅外光譜圖(4 000～400 cm-1)Fig.3 Second derivative infrared spectra of nineteen batches of samples (4 000-400 cm-1)

表3 19批樣品紅外二階導數光譜相似度(%)

3個品種在1 800～400 cm-1處的二階導數紅外光譜圖見圖4，可知三者峰形和峰強均有明顯差異，可用于鑒別。其中，區域1粉枝莓、黑腺美飾懸鉤子有3個向上的鋸齒，而紅泡刺藤有4個，可將前兩者和后者區分開；區域10粉枝莓明顯有3個向上的鋸齒，而紅泡刺藤、黑腺美飾懸鉤子不明顯；區域5、8中，粉枝莓、黑腺美飾懸鉤子峰形相似，但前者峰強更高。

圖4 3個品種二階導數紅外光譜圖(1 800～400 cm-1)Fig.4 Second derivative infrared spectra of three species (1 800-400 cm-1)

3.3 聚類分析 將19批樣品全波段譜圖進行二階求導處理后，利用平方歐式距離和Ward系統聚類法進行系統聚類分析[20]，結果見圖5。由此可知，3個品種聚類效果較差，19批樣品混雜無法分開，其中粉枝莓最為分散，表明其品質差異最大，與圖3～4一致；FZM-1和FZM-2、HP-2和HP-3為同一地點采集，但FZM-1和HP-2為老枝，FZM-2和HP-3為嫩枝，并且圖中FZM-1和FZM-2、HP-2和HP-3差異很大；距離系數為7時，除了嫩枝HX-3外，其余黑腺美飾懸鉤子品種均聚為一類，在一定程度上反映了生長時間對藥材品質有很大影響，甚至超過品種本身的影響，同時也說明3個品種所含成分的類型或含量差異較小。

圖5 19批樣品聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis dendrogram for nineteen batches of samples

3.4 主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 基于19批樣品的二階導數紅外光譜圖，建立PCA[21]、OPLS-DA[20,22]模型，見圖6～7。由圖6A可知，紅泡刺藤單獨聚為一類，靠近黑腺美飾懸鉤子，表明兩者所含成分相似；粉枝莓、黑腺美飾懸鉤子出現混雜情況，交叉樣品為FZM-2、FZM-4、FZM-5，而FZM-1、FZM-6游離在外，與各批次其他2個品種的距離均較遠，與聚類分析結果一致。由圖6B可知，3個品種各自聚在一起，比二維聚類效果好，但不同品種之間距離近，界限不清，難以進行明確區分。由圖7可知，3個品種各自聚為一類，界限明顯，但同一品種不同批次樣品之間的距離仍有一定差異，可能受到不同產地氣候、土壤或同一產地植株成熟程度等因素的影響，導致其品質有所不同。

圖6 3個品種PCA二維得分(A)、三維得分圖(B)Fig.6 2D score plot (A) and 3D score plot (B) for PCA of three species

圖7 3個品種OPLS-DA二維得分(A)、三維得分(B)圖Fig.7 2D score plot (A) and 3D score plot (B) for OPLS-DA of three species

3.5 外部驗證試驗 取FZM-7、HP-5、HX-10、GJ、JH、HZ適量，按“3.4”項下方法進行鑒別，結果見圖8。由此可知，HP-5明顯與紅泡刺藤聚為一類，FZM-7明顯與粉枝莓聚為一類，HX-10明顯與黑腺美飾懸鉤子聚為一類，不屬于主流品種的GJ、JH、HZ游離在主流品種外面，表明OPLS-DA具有良好的鑒別能力。

4 討論

本研究采用傅里葉變換紅外光譜對藏藥懸鉤木3個主流品種進行鑒別研究，發現19批樣品的紅外光譜圖整體相似，3個品種特征峰區別不明顯；經二階導數處理后，發現吸收區1 800～400 cm-1為3個品種的主要鑒別區域，其中粉枝莓和黑腺美飾懸鉤子的吸收差異較小。根據紅外光譜圖、二階導數光譜圖的相似度和聚類分析結果，發現紅泡刺藤品質最為穩定，不同產地粉枝莓受地域影響嚴重、品質差異大；同時發現，植物的生長時間對藥材品質的影響最大，甚至超過產地和品種對藥材品質的影響。在研究中采用的3種化學計量學方法中，PCA和OPLS-DA能夠對粉枝莓、紅泡刺藤和黑腺美飾懸鉤子進行區分，其中OPLS-DA的分類結果最好。外部驗證試驗結果顯示，FZM-7、HP-5和HX-10都正確地與相應品種聚為一類，證明建立的OPLS-DA鑒別方法對三個主流品種具有良好的鑒別能力。本研究為粉枝莓、紅泡刺藤和黑腺美飾懸鉤子的鑒別提供了快速、簡便的方法，也為藏藥懸鉤木的鑒別和質量評價提供了科學依據。