三棱中含氮類成分的研究

鄧可眾， 劉 聰， 楊 堃， 宗 琪， 王雨晴， 熊 英*

(1.江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121)

三棱為黑三棱科黑三棱屬植物黑三棱SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖, 具有破血行氣、消積止痛之效,用于治療癥瘕痞塊、痛經、瘀血經閉、胸痹心痛、食積脹痛[1]。三棱含有苯丙素、黃酮、生物堿、三萜以及環二肽等多種成分[2]，目前有關苯丙素類(如阿魏酸蔗糖酯衍生物)的研究較多[3-4]，但僅報道了5個生物堿[2,5]、3個環二肽[6]，其中環(苯丙氨酸-酪氨酸)的抗凝效果顯著，鋁絡合生物堿Grailsine-Al-glycoside具有抗HeLa宮頸癌活性[5]，表明該類含氮化合物也是三棱藥效成分。本實驗主要報道三棱中含氮類成分，以期為其活性成分的闡明、藥材及相應制劑質量標準的提高及開發利用奠定基礎。

1 材料

Avance HD型核磁共振儀 (德國Bruker公司，600 MHz)；BS224S電子分析天平(德國賽多利斯公司)；EYELA 1100旋蒸儀(上海愛朗儀器有限公司)；ZF-1三用紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；Triple TOF 5600 質譜儀(美國AB SCIEX公司)；Waters 2489 Alliance Separations Module制備HPLC儀(美國Waters公司)；ODS-AQ色譜柱(20 mm×250 mm，5 μm，日本YMC公司)。Sephadex LH-20(美國Amersham公司)；XAD-16大孔樹脂(美國羅門哈斯公司)；GF254薄層硅膠 (青島海洋化工廠)；柱色譜硅膠 (100～200、200～300目，青島海洋化工廠)。純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；色譜純甲醇 (國藥集團上海有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷等試劑均為分析純；顯色試劑為10%硫酸乙醇、2%茚三酮試劑以及改良碘化鉍鉀。

三棱于2016年購于江西省樟樹藥材市場，經重慶市食品藥品檢驗檢測研究院楊堃副主任藥師鑒定為黑三棱科黑三棱屬黑三棱SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖。

2 提取與分離

取三棱干燥塊莖40 kg，粉碎后用95%、65%乙醇依次滲漉提取，減壓濃縮得浸膏2.7 kg，加水混懸，水飽和的石油醚、乙酸乙酯(約30 L)依次萃取，減壓濃縮得石油醚層80 g、乙酸乙酯層180 g。取乙酸乙酯層浸膏180 g，經ODS柱以甲醇-水梯度洗脫，得12個流分，其中第9流分(2.4 g)經硅膠柱以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，再經制備HPLC甲醇-水(4∶6)純化得化合物1(26.6 mg)。乙酸乙酯萃取后的剩余物采用大孔樹脂柱分離，以水及30%、50%、70%、95%乙醇依次洗脫，30%乙醇洗脫部分經開放ODS柱分離以甲醇-水(2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、1∶0)梯度洗脫，得到15個組分，其中組分2析出結晶，再經重結晶得化合物8(2.0 mg)；組分3經Sephadex LH-20甲醇-水(6∶4)洗脫，得化合物4(10.5 mg)、5(2.0 mg)；組分4經Sephadex LH-20以甲醇-水(6∶4)洗脫，再經制備HPLC以甲醇-水(2∶8)純化得化合物2(9.2 mg)、3(13.7 mg)；組分5經Sephadex LH-20以甲醇-水(6∶4)洗脫，再經制備HPLC以甲醇-水(2∶8)純化得化合物6(7.9 mg)。將50%乙醇洗脫部分經硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(5∶1、4∶1、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10、0∶1)梯度洗脫，共得到12個組分，第2組分經Sephadex LH-20柱層析以甲醇-水(6∶4)洗脫，再經MCI柱層析以甲醇-水(0∶1～1∶0)梯度洗脫，重結晶純化得化合物7(180 mg)、9(34 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：黃色油狀物，ESI-MSm/z239.2[M+H]+，分子式C12H17NO4。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 9.46 (1H, s, H-6′)，7.01 (1H, d,J=4.2 Hz, H-3′)，6.31 (1H, d,J=4.2 Hz, H-4′)，4.51 (2H, s, H-7′)，4.38 (2H, m, H-4)，3.68 (3H, m, H-5)，3.37 (3H, s, H-8′)，2.38 (2H, t,J=7.2 Hz, H-2)，2.03 (2H, m, H-3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ: 174.2 (C-1)，30.8 (C-2)，26.6 (C-3)，45.0 (C-4)，51.3 (C-5)，133.0 (C-2′)，125.1 (C-3′)，112.1 (C-4′)，140.2 (C-5′)，180.3 (C-6′)，65.5 (C-7′)，57.4(C-8′)。以上數據與文獻[7]基本一致，故鑒定為methyl4-[formyl-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoate。

化合物2：淡黃色針狀結晶，ESI-MSm/z：231.1[M-H]-，分子式C13H16N2O2。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 1.76 (3H，d，J=7.2 Hz, H-10), 3.04 (1H, m, H-4a), 3.46 (1H, dd,J=4.8, 16.8 Hz, H-4b), 3.98 (1H, m, H-3), 4.73 (1H, d,J=6.6 Hz, H-1), 7.07 (1H, t,J=7.2 Hz, H-6), 7.16 (1H, t,J=7.2 Hz, H-7),7.36 (1H, d,J=7.8 Hz, H-8), 7.50 (1H, d,J=7.8 Hz, H-5);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 17.1 (C-10), 24.3 (C-4), 51.1 (C-1), 59.8 (C-3), 107.9 (C-4a), 112.3 (C-8), 119.2 (C-5), 120.6 (C-6), 123.3 (C-7), 127.5 (C-4b), 131.4 (C-8a), 138.6 (C-9a), 173.4 (C-11)。以上數據與文獻[8]基本一致，故鑒定為(1S,3S)-1,2,3,4-tetrahydro-1-methyl-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物3：淡黃色針狀結晶，茚三酮不顯色，薄層原位水解反應顯陽性，提示為肽類。ESI-MSm/z：275.1[M-H]-，分子式C14H16N2O4。13C-NMR中有2個酰胺羰基碳的特征信號δ168.6，168.1，推測為環二肽。1H-NMR中的δH7.23 (2H, m, H-9,13), 7.32 (2H, m, H-10,12), 7.26 (1H, m, H-11)為單取代苯環的5個質子信號，對應的6個芳環碳信號為δC134.9 (C-8), 130.3 (C-9,13), 128.5 (C-10,12), 127.5 (C-11)，1H-1H COSY譜顯示1個亞甲基δH2.98 (1H, dd,J=4.8, 13.8 Hz, H-7b)，3.30 (1H, m, H-7a)和1個次甲基δH4.34 (1H, m, H-3)具有鄰位偶合的關系，HMBC譜顯示該3個氫質子與苯環上的δC134.9 (C-8)及酰胺羰基碳δC168.6均有遠程相關，以上NMR數據與苯丙氨酸[9]十分相似，推測分子中存在1個苯丙氨酸片段；此外，1H-NMR中顯示1個次甲基質子信號δH3.83 (1H, m, H-6)，高場部分還有2個亞甲基質子信號δH1.32 (1H, m, H-14a), 0.98 (1H, m, H-14b), 1.88 (2H, m, H-15)。1H-1H COSY 譜顯示亞甲基δH1.32，0.98與亞甲基δH1.88和次甲基δH3.82 均有偶合關系，表明結構中存在-CH-CH2-CH2-基團；13C-NMR中除酰胺羰基碳信號δC168.6外，還可見δC174.8 (C-16)的羧基碳信號，HMBC 譜顯示2個羰基碳δC174.8、168.1與亞甲基δH1.32，0.98、亞甲基δH1.88均有遠程相關，推測分子中還存在1個谷氨酸結構片段，故鑒定為環(谷氨酸-苯丙氨酸)，該化合物已有人工合成的報道，本實驗所得為新天然產物，其結構見圖1，NMR數據見表1。

圖1 化合物3結構和主要HMBC與1H-1H COSY相關Fig.1 Structure and correlations between key HMBC and 1H-1H COSY of compound 3

表1 化合物3的1H-NMR(600 MHz，CD3OD)及13C-NMR(150 MHz，CD3OD)數據

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z：261.1[M+H]+，分子式C15H20N2O2。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.33 (1H, m, H-3), 3.82 (1H, m, H-6), 3.30 (1H,J=3.6, 13.8 Hz, H-7a), 2.94 (1H, dd,J=4.8, 13.8 Hz, H-7b), 7.22 (2H, m, H-9,13), 7.29 (2H, m, H-10,12), 7.21 (1H, m, H-11), 0.88 (1H, m, H-14a), 0.11 (1H, m, H-14b), 1.42(1H, m, H-15), 0.75 (3H, d,J=6.6 Hz, H-16), 0.73 (3H, d,J=6.6 Hz, H-17);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 170.7 (C-2), 57.3 (C-3), 169.2 (C-5), 54.1 (C-6), 39.4 (C-7), 136.5 (C-8), 131.6 (C-9,13), 129.7 (C-10,12), 128.6 (C-11), 45.2 (C-14), 24.7 (C-15), 23.4 (C-16), 21.4 (C-17)。以上數據與文獻[10]基本一致，故鑒定為環(亮氨酸-苯丙氨酸)。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z：180.1[M-H]-，分子式C9H11NO3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ:6.99 (2H, d,J=8.4 Hz, H-2′,6′), 6.71 (2H, d,J=8.4 Hz, H-3′,5′), 4.03 (1H, t,J=3.6 Hz, H-2), 2.80 (1H, dd,J=3.6, 14.4 Hz, H-3a), 2.42 (1H, dd,J=4.8, 14.4 Hz, H-3b);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 170.7 (C-1), 127.1 (C-1′), 132.8 (C-2′,6′), 116.4 (C-3′,5′), 158.1 (C-4′), 57.6 (C-2), 50.5 (C-3)。以上數據與文獻[11]基本一致，故鑒定為酪氨酸。

化合物6：白色粉末，ESI-MSm/z：164.2[M-H]-，分子式C9H11NO2。1H-NMR (D2O, 600 MHz)δ: 7.32～7.21 (5H, m, H-2′,3′,4′,5′,6′), 3.88 (1H, m, H-2), 3.17 (1H, m, H-3a), 3.01 (1H, m, H-3b);13C-NMR (D2O, 150 MHz)δ: 173.9 (C-1), 58.0 (C-2), 36.3 (C-3), 135.0 (C-1′), 129.3 (C-2′,6′), 129.1 (C-3′,5′), 127.6 (C-4′)。以上數據與文獻[9]基本一致，故鑒定為苯丙氨酸。

化合物7：白色針狀結晶，ESI-MSm/z：130.1[M+H]+，分子式C5H7NO3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.27 (1H, dd,J=4.8, 9.0 Hz, H-5), 2.51 (1H, m, H-3a), 2.36 (2H, m, H-4), 2.19 (1H, m, H-3b);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 179.7(C-2), 174.3 (C-6), 55.6 (C-5), 29.0 (C-3), 24.7 (C-4)。以上數據與文獻[12]基本一致，故鑒定為焦谷氨酸。

化合物8：淡黃色針狀結晶，ESI-MSm/z：275.1[M-H]-，分子式C15H20N2O3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.03 (1H, t,J=3.6 Hz, H-3), 3.45 (1H, m, H-6), 3.10 (1H, dd,J=3.6,14.4 Hz, H-7a), 2.78 (1H, dd,J=4.8, 14.4 Hz, H-7b), 6.79 (2H, d,J=8.4 Hz, H-9,13), 6.51 (2H, dd,J=8.4 Hz, H-10,12), 0.68 (1H, m, H-14a), 0.11 (1H, m, H-14b), 1.22 (1H, m, H-15), 0.65 (3H, d,J=6.6 Hz, H-16), 0.63 (3H, d,J=6.6 Hz, H-17);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 168.7(C-2), 55.6 (C-3), 167.1(C-5), 52.1(C-6), 37.4(C-7), 125.1(C-8), 130.8 (C-9,13), 114.4 (C-10,12), 156.1 (C-11), 43.2 (C-14), 22.7 (C-15), 21.4 (C-16), 20.3(C-17)。以上數據與文獻[13]基本一致，故鑒定為環(亮氨酸-酪氨酸)。

化合物9：白色粉末，ESI-MSm/z：268.1[M+H]+，分子式C10H13N5O4。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ: 8.23 (1H, s, H-8)，8.02 (1H, s, H-2)，7.26 (2H, s, NH2)，5.74 (1H, d,J=6.0 Hz, H-1′), 4.48 (1H, dd,J=11.4,6.0 Hz, H-2′)，4.02 (1H,brs, H-3′), 3.84 (1H, d,J=3.6 Hz, H-4′), 3.55 (1H, m, H-5′a), 3.45 (1H, m, H-5′b), 5.36 (1H, d,J=6.0 Hz, 2′-OH), 5.32 (1H,brs, 3′-OH), 5.10 (1H, d,J=4.2 Hz, 5′-OH)；13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ: 153.8 (C-2), 150.4 (C-4), 120.8 (C-5), 155.6 (C-6), 141.4 (C-8), 89.3 (C-l′), 74.9 (C-2′), 72.1 (C-3′), 87.3 (C-4′), 63.0 (C-5′)。以上數據與文獻[14]基本一致，故鑒定為腺苷。

4 討論

前期課題組對三棱粗提物進行家兔體外APTT(活化部分凝血酶原時間)檢測，發現三棱石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位及水部位具有較好的抗凝活性，時間分別為16.4、22.0、21.7、27.5 s(空白為13.3 s)，故本實驗對乙酯部位和乙酸乙酯萃取后剩余的極性較大部位(正丁醇、水)化學成分進行研究，從中分離鑒定了9個含氮化合物，其中化合物3為新天然產物，1～2、4～7為首次從該屬植物中分離得到。環二肽類成分的薄層層析直接采用茚三酮試劑無法顯色，參考文獻[15]的原位水解法即先用濃鹽酸水解，然后再噴灑茚三酮試劑的顯色方法。生物堿、環二肽均為三棱中活性成分類型[5-6]，本實驗為活血中藥三棱藥效物質的全面闡明提供了化學成分基礎。