二十五味鬼臼丸的植物雌激素樣作用及其對雌激素受體的調控

王 琦， 李淑楨， 代冬芳， 張立雪， 吳佩鋒， 李長興*

(1.青海大學醫學院基礎醫學部，青海 西寧 810006；2.西北民族大學醫學部，甘肅 蘭州 730000)

圍絕經期是指女性由性成熟期進入老年期的過渡時期，最顯著的變化是卵巢功能衰退，最終卵巢內卵泡耗竭，雌激素及抑制素水平降低，引起一系列癥狀和體征，又稱圍絕經期綜合征[1]，其臨床癥狀比較復雜，卵巢功能減退引起的雌激素缺乏將導致女性出現絕經晚期發生骨質疏松和老年癡呆等疾病，嚴重影響其生活質量[2]。雌激素-孕激素合用治療被世界衛生組織癌癥研究機構列在致癌物清單中[3]，故人們將目光轉到更加安全有效的植物雌激素上，植物雌激素是指存在于植物中的具有類雌激素效應的天然產物，其化學結構與內源性雌二醇(estradiol，E2)相似，根據化合物單體結構差異可分為木脂素、異黃酮、香豆素、二苯乙烯[4]。植物雌激素為一種天然的選擇性雌激素受體調節劑，可在體內起到模仿或調節內源性雌激素的作用，緩解女性圍絕經期綜合征癥狀并防止長期應用雌激素所誘發的風險[5-6]。

鬼臼是二十五味鬼臼丸的主要成分，含有木脂素等植物雌激素，臨床證實該制劑具有雌激素樣作用，對圍絕經期綜合征有良好的預防及治療作用，在治療月經不調、婦女血癥等方面有一定療效[7-8]，但其作用機制仍在不斷探索中。本研究通過建立圍絕經期綜合征大鼠模型，觀察二十五味鬼臼丸對圍絕經期綜合征大鼠血清激素水平及子宮組織中雌激素受體(estrogen receptor，ER)亞型表達的影響，以期為該制劑后續臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 動物 60只SPF級雌性SD大鼠，3月齡，體質量200～220 g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心所提供，實驗動物生產許可證號SCXK(陜)2017-003，飼養溫度(22±1) ℃，相對濕度50%～60%，自由攝食進水，12 h/12 h晝夜自然規律。整個實驗過程遵循本單位實驗動物倫理委員會相關規定。

1.2 試劑與藥物 戊酸雌二醇片(德國拜耳公司，批號201710BJ125)；二十五味鬼臼丸(青海省藏醫院，國藥準字Z20140539，0.35 g×49丸/瓶，批號626189)。大鼠雌二醇(E2) ELISA試劑盒、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒、促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒(江蘇酶標生物科技有限公司，批號分別為MM-0575R1、MM-0587R1、MM-0566R1)；TRIzol Reagent(美國Ambion公司，批號229001)；PCR引物由日本TaKaRa公司合成；RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號分別為S7513、S7422]；β-actin(英國Abcam公司，貨號ab8227)；大鼠ERα多克隆抗體、大鼠ERβ多克隆抗體(英國Abcam公司，批號分別為GR3230941-3、GR3236514-1)；脫脂奶粉、SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、SDS-PAGE電泳液、轉膜液[生工生物工程股份(上海)有限公司，批號分別為G601BA0002、FC09DA0001、103019200520、121319200519]；彩虹245廣譜蛋白Marker(北京索萊寶生物科技有限公司，批號1223C022)；5×蛋白上樣緩沖液(武漢塞維爾生物科技有限公司，批號HJ195108)；BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號14I29C46)；ECL顯影液(愛必信上海生物科技有限公司，批號OA16)；DAPI染色液(上海碧云天生物技術有限公司，批號C1006)；Cy3標記羊抗兔IgG(北京博奧森生物工程有限公司，批號A0516)。

1.3 儀器 高速離心機(德國Eppendorf公司)；多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司)；Nanodrop 2000(美國Thermo公司)；Light Cycler96實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；全景切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；FlourChem R多功能成像分析系統(美國Protein Simple公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組、模型組、雌二醇組、二十五味鬼臼丸組，每組15只，模型建立方法參考文獻[9]，術前12 h禁食不禁水，稱定體質量后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，左側背部最末肋骨下腋中線上距脊柱約2 cm處完整地切除雙側卵巢，假手術組剪除卵巢周圍體積等大的脂肪組織，不摘卵巢，其余各組行雙側卵巢切除術，術后肌肉注射青霉素(20 000 IU/只)預防感染，連續3 d。術后5 d，對大鼠逐只進行陰道涂片，每天1次，連續5 d，若不出現動情期反應則表示造模成功。手術后恢復2周時開始給藥，按照臨床等效劑量換算后，雌二醇組劑量為0.1 mg/kg，用蒸餾水配成0.01 mg/mL混懸液；二十五味鬼臼丸組劑量為360 mg/kg，蒸餾水配成0.36 g/mL混懸液；假手術組和模型組灌胃等容量生理鹽水，隔天給藥，持續8周。

2.2 樣本制備 各組大鼠末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血5 mL，室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱中保存。摘取大鼠子宮，生理鹽水沖洗，濾紙吸干組織表面水分，電子天平準確稱定濕質量，計算子宮指數(uterine index，UI)，公式為UI=子宮組織濕質量/大鼠體質量，取一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分在液氮中保存用于后續實驗。

2.3 ELISA法檢測大鼠血清E2、LH、FSH水平 嚴格按照相關試劑盒說明書步驟，采用ELISA法檢測血清E2、LH、FSH水平。

2.4 RT-qPCR檢測大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達 取大鼠子宮組織約100 mg，加入Trizol提取組織總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書步驟將其反轉錄成cDNA，核酸分析儀檢測RNA濃度及純度后檢測吸光度。實時熒光定量PCR反應條件為42 ℃，15 min；95 ℃，3 min，共40個循環。β-actin為內參基因，記錄各樣本CT值采用2-ΔΔCT相對定量法計算目的基因相對表達，每個樣本的ΔCT=CT目的基因-CT內參，ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 Western blot檢測大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達 從大鼠子宮組織勻漿中提取總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，上樣量為30 μg，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后10%脫脂牛奶封閉2 h，PBST洗膜，4 ℃孵育多克隆抗體ERα(1∶1 000)、ERβ(1∶1 000) 10～14 h，洗膜后孵育二抗(1∶10 000)，室溫靜置1 h，洗膜，ECL顯色，曝光。采用AlphaEase FC軟件對條帶進行分析，以β-actin為內參，計算ERα、ERβ蛋白相對表達。

2.6 免疫熒光雙標檢測ERα、ERβ蛋白表達 將大鼠子宮組織切片后放入二甲苯中，乙醇梯度脫水，蒸餾水沖洗，置于EDTA抗原修復緩沖液(pH 9.0)中，高壓抗原修復2.5 min，冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中，脫色搖床上洗滌3次，每次5 min，輕輕甩掉封閉液，滴加ERα一抗(1∶200)、ERβ一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜，加入熒光標記二抗(1∶300)，37 ℃孵育1 h，DAPI復染細胞核封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，圖像用Image J 6.0軟件分析，計算平均熒光強度。

3 結果

3.1 二十五味鬼臼丸對大鼠子宮指數的影響 與假手術組比較，模型組大鼠子宮指數降低(P<0.01)；給藥8周后，與模型組比較，二十五味鬼臼丸組、雌二醇組大鼠子宮指數升高(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠體質量、子宮指數

3.2 二十五味鬼臼丸對大鼠血清E2、LH、FSH水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清E2水平降低(P<0.01)，LH、FSH水平升高(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組、雌二醇組大鼠血清E2水平升高(P<0.01)，LH、FSH水平降低(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠血清E2、LH、FSH的水平

3.3 二十五味鬼臼丸對大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組大鼠子宮組織ERαmRNA表達無明顯變化(P>0.05)，ERβmRNA表達升高(P<0.05)，而雌二醇組兩者mRNA表達均升高(P<0.01)，見圖1。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ mRNA表達Fig.1 mRNA expressions of ERα and ERβ in uterine tissue of rats in various

3.4 二十五味鬼臼丸對大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組ERα、ERβ蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組ERα蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，ERβ蛋白表達升高(P<0.01)，而雌二醇組兩者蛋白表達均升高(P<0.01)，見圖2。

注：A為Western blot條帶，B為半定量分析。與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達Fig.2 Protein expressions of ERα and ERβ in uterine tissue of rats in various groups

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ熒光染色(×200)Fig.3 Fluorescence staining of ERα and ERβ in uterus tissues of rats in various groups (×200)

3.5 免疫熒光雙標檢測大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達 免疫熒光染色(圖3)顯示，ERα蛋白表達陽性為紅色，ERβ蛋白表達陽性為綠色。ERα免疫熒光強度結果(圖4)顯示，與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織ERα平均熒光強度降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組大鼠子宮組織ERα平均熒光強度無明顯變化(P>0.05)，而雌二醇組其平均熒光強度升高(P<0.01)。ERβ免疫熒光強度結果(圖4)顯示，與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織ERβ平均熒光強度降低(P<0.01)；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組、雌二醇組大鼠子宮組織平均熒光強度升高(P<0.01)。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖4 各組大鼠子宮組織ERα、ERβ熒光強度Fig.4 Fluorescence intensities of ERα and ERβ in uterine tissue of rats in various groups

4 討論

雌二醇(E2)是人體內生物活性最強的雌激素，通過與ER結合在體內發揮作用，其作用與ER的類型和數量有關[10]。ER屬于核受體超家族，其亞型包括經典的核受體ERα、ERβ。近年來，植物雌激素被稱為“選擇性雌激素受體調節劑”，其化學結構與內源性雌激素E2結構相似，也可結合體內的ER，在體內具有雙重調節作用[11-12]。在體內雌激素水平較低時，其與ER結合，發揮雌激素樣作用；雌激素水平較高時，其與ER競爭性結合阻止強活性的E2與ER結合，發揮拮抗雌激素的作用[13]。經典的雌激素作用通路是雌激素首先與相應的ER結合，ER被雌激素樣化合物激活后，ER受體二聚化形成二聚體復合物 (ERα-α、ERα-β、ERβ-β)，ER以二聚體的形式結合到靶基因的雌激素反應元件序列并激活靶基因[14-15]。

圍絕經期綜合征由一系列精神及軀體表現組成，其發病機理復雜，圍絕經期婦女各項生理功能都會出現不同程度的異常，主要表現為月經變化、乏力、情緒易激動、多慮、抑郁、心悸、失眠等[16]。最早表現為卵巢功能衰退，繼而表現為下丘腦-垂體功能退化，激素水平改變，主要表現為E2和FSH、LH，分泌抑制垂體的因子減少，導致下丘腦-垂體負反饋功能障礙，出現下丘腦-垂體-卵巢軸失衡[17-18]。

本實驗通過構建圍絕經期綜合征大鼠模型，用二十五味鬼臼丸干預治療，觀察其對UI、子宮血清激素變化及子宮ER表達的影響。研究結果顯示，與模型組比較，二十五味鬼臼丸組UI及血清E2水平升高，而LH、FSH水平降低，說明二十五味鬼臼丸有效改善圍絕經期綜合征所引起的激素紊亂。RT-qPCR結果顯示，模型組ERα、ERβmRNA表達降低，二十五味鬼臼丸組子宮ERαmRNA表達無明顯變化，而ERβmRNA表達升高；Western blot及免疫熒光雙標結果顯示，二十五味鬼臼丸主要通過ERβ提高ER的生物學效應，這與王婷等[19]研究發現，4種木脂素類植物雌激素與對ERβ結合親和力均高于ERα的研究一致。陳嘉彥等[20]研究發現，正常子宮內膜組織中ERβ蛋白陽性表達率高于子宮內膜癌組織中ERβ蛋白陽性表達率，ERβ的下調可能與子宮內膜癌的發生有關。因此，與其他對ERα親和力較高的植物雌激素相比，選擇性激動ERβ不會引起相應的細胞增殖作用，二十五味鬼臼丸可通過提高大鼠子宮ERβ表達，改善大鼠血清激素水平，可能是其治療圍絕經期綜合征的作用機制之一。

綜上，本研究初步確定二十五味鬼臼丸對圍絕經期綜合征大鼠血清激素及子宮組織中ERβ具有調控作用，表現出二十五味鬼臼丸類似選擇性雌激素受體調節劑作用，為藏藥二十五味鬼臼丸發揮的臨床應用的有效性和安全性提供了依據。