半夏瀉心湯含藥血清對胃癌細胞來源外泌體誘導BMSCs增殖、遷移、侵襲的影響

董俊剛， 劉喜平*， 李沛清， 王慶苗， 朱中博， 崔國寧

(1.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學中醫臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000)

胃癌目前居腫瘤性死亡病因的第2位[1]，其發生發展與骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)有關[2]。在胃癌前病變期BMSCs可歸巢至胃黏膜部，參與胃黏膜修復，與胃上皮細胞融合轉化為胃癌細胞[3]；胃癌發生后，BMSCs可歸巢至腫瘤部位，成為腫瘤微環境的重要細胞成分[4]，能促進腫瘤的生長進展[5]。課題組前期研究表明，BMSCs在胃癌微環境中可發生惡性轉化，從而具有體內致瘤特性[5-6]。

外泌體(exosome，Exo)是微環境細胞間生物信息物質傳遞的生物活性囊泡，它富集、包裹了在細胞外液中易失活或降解的成分，可靶向受體細胞并被攝取，激活胞內相關信號通路，調控受體細胞生物學特性。研究顯示，胃癌微環境中的胃癌細胞能通過分泌的外泌體誘導BMSCs促進腫瘤生長轉移[7]。音猬因子(sonic hedgehog，Shh)信號通路是調控BMSCs增殖分化的關鍵信號通路[8]，但胃癌來源外泌體能否靶向BMSCs，調控BMSCs胞內Shh信號通路，誘導BMSCs生物學特性的惡性轉化，以及上述過程能否被干預目前并不清楚。

胃癌屬中醫“伏梁”“反胃”“積聚”等范疇，其病機與寒熱錯雜、正虛痰結有關[9]。半夏瀉心湯源自《傷寒論》，功效平調寒熱、健脾散結，是治療胃癌的有效方劑[10]。課題組前期研究表明，半夏瀉心湯對荷胃癌裸鼠有明顯的抑瘤作用[11]，也可抑制人胃癌BGC-823細胞生長增殖[12-13]，同時對胃癌微環境中BMSCs的惡變促瘤有明顯的抑制作用[14]。本研究在觀察半夏瀉心湯干預BMSCs攝取胃癌來源外泌體的基礎上，探討該方通過調控Shh信號通路對胃癌來源外泌體誘導BMSCs增殖、侵襲、遷移等生物學特性的影響，從腫瘤外泌體途徑闡釋BMSCs的惡變促瘤機制，為胃癌臨床治療及相關藥物新作用靶點開發提供依據。

1 材料

1.1 細胞與動物 人胃癌NCI-N87細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；大鼠BMSCs(細胞密度2×105/mL)，由重慶威斯騰生物科技公司分離提供。8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質量180～220 g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號SCXK(甘)2020-0001，動物使用許可證號SYXK(甘)2020-0009，飼養于溫度23～25 ℃、相對濕度(50 ±10)%的SPF級實驗室。研究經甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(倫理審查號2018-009)。

1.2 試劑與藥物 半夏瀉心湯組方藥材飲片(半夏、干姜、黃芩、黃連、人參、大棗、甘草)均購自甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥房，經甘肅中醫藥大學藥學院景明教授鑒定符合2020年版《中國藥典》規定。胎牛血清、無外泌體血清、DMEM培養基(美國Gibco公司，貨號分別為HLC0101、10828-028、11995-065)；微量BCA蛋白定量試劑盒(上海易色醫療科技有限公司，貨號BC201)；Exo-Quick-TC(美國SBI公司，貨號EXOTC50A-1)；MTT試劑盒、兔來源一抗CD63、兔來源一抗CD9、二抗羊抗兔IgG、二抗羊抗鼠IgG、β-actin(英國Abcam公司，貨號分別為20140165、ab92726、ab92643、ab6728、ab150077、ab8226)；Matrigel基質膠(美國Corning公司，貨號356234)；兔一抗Gli1(美國Thermo Fisher公司，貨號MA5-32553)；兔一抗Ptch1(藥明康德，貨號AP51457)；兔一抗c-Myc(美國CST公司，貨號9402)；小鼠一抗Shh(美國Santa Cruz公司，貨號sc-373779)；兔一抗Smo(成都正能生物技術有限公司，貨號503274)；結晶紫、1,1′-雙十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，Dil)(美國Sigma公司，貨號分別為C6158、41085-99-8)；DAPI染色液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號C1005)；Shh阻斷劑GANT61(美國MCE公司，貨號HY-13901)。

1.3 儀器 透射電子顯微鏡7500(日本Hitachi公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)；8 μm Transwell小室(美國Corning公司)；細胞計數板(上海醫用儀器廠)。

2 方法

2.1 含藥血清制備及大鼠分組、給藥 按原方劑量(半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，大棗4枚，甘草9 g)稱取組方藥材飲片[15]，混合后浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍量水煎煮1.5 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并煎液，離心過濾，濾液分別減壓濃縮至生藥量2.7、1.35、0.675 g/mL。按照人與動物體表面積折算的等效劑量(中劑量為臨床等劑量，低、高劑量組分別是中劑量的0.5、2倍)，半夏瀉心湯低、中、高劑量組劑量分別為54、27、13.5 g/kg。

參考文獻[16]報道的方法，32只大鼠常規適應性飼養1周后，隨機數字表法分為空白組及半夏瀉心湯低、中、高劑量組，每組8只，實驗前禁食不禁水12～24 h，半夏瀉心湯低、中、高劑量組大鼠每次分別灌胃給予2.7、1.35、0.675 g/mL的半夏瀉心湯，每天2次，每次2 mL，空白組灌胃給予等體積生理鹽水灌胃，連續2周。末次給藥后1 h麻醉大鼠，腹腔解剖，腹主動脈采集全血，靜置分層后3 000 r/min離心10 min，收集血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.2 NCI-N87外泌體分離和純化 收集正常培養的NCI-N87細胞，PBS洗2～3次，更換為無外泌體血清培養基，繼續培養48 h后收集上清，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，0.22 μm濾膜過濾去除較大的囊泡，將外泌體上清與Exo Quick-TC試劑以5∶1的比例混合，反復顛倒3次，4 ℃孵育過夜，10 000 r/min離心30 min，棄去上清液，沉淀用0.5 mL PBS重懸，獲得提取物懸液，按微量BCA蛋白定量試劑盒說明書對提純后的NCI-N87-Exo進行定量，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.3 NCI-N87外泌體鑒定 取分離純化NCI-N87-Exo溶液20 μL，均勻后滴加于直徑2 mm的載樣銅網上，在干燥環境中讓Formvar膜吸收20 min，將100 μL PBS加到封口膜上，用鑷子將銅網放在PBS液滴上清洗。50 μL 2.5%戊二醛滴于銅網上，室溫下復染5 min，反差增強及包埋樣本后，置于透射電鏡下(80 kV)觀察拍攝并保存。將NCI-N87外泌體用細胞裂解液處理后，4 ℃離心5 min，取上清液，BCA法檢測濃度，Western blot法檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63及鈣網蛋白(calreticulin)表達，加入6×蛋白樣品上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min變性。以20 μg總蛋白量進行點樣、電泳、轉膜、洗滌封閉，結合一抗 (CD9、CD63、calreticulin，稀釋倍數均為1∶1 000)4 ℃過夜，洗滌，室溫結合二抗 (山羊抗兔IgG按1∶1 000稀釋) 孵育2 h，洗滌，ECL化學發光液顯影法檢測蛋白條帶，Image J軟件分析灰度值。

2.4 細胞分組及共培養體系建立 將分離純化后質量濃度為100 μg/mL的NCI-N87外泌體與熒光活性染料Dil按1 000∶1的比例混合，避光放置30 min，4 ℃、100 000 r/min離心90 min，PBS重懸后再次超速離心，棄上清，獲得Dil標記的NCI-N87外泌體。實驗分為空白組，模型組，半夏瀉心湯低、中、高劑量組及Shh阻斷劑組，各組上室加入2×105/mL BMSCs懸液1.5 mL(DMEM培養基+100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)，下室均加入無外泌體血清的培養基(DMEM培養液中+10%無外泌體血清+100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)。除空白組外，其他各組下室加入含1 mL質量濃度為100 μg/mL的NCI-N87外泌體，半夏瀉心湯高、中、低劑量組上室內各加入10%的半夏瀉心湯含藥血清，模型組及空白組上室加入10%的空白血清，Shh阻斷劑組上室加入含20 μmol/L GANT61的10%空白血清。48 h后終止培養，收集細胞，倒置相差顯微鏡下觀察各組BMSCs的形態變化，并進行其他相關檢查。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取 收集各組BMSCs，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，吸取培養液，4%多聚甲醛固定，PBS清洗細胞，常溫細胞爬片15 min，PBS洗滌3次，每次10 min，滴加含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(4′，6-diamino-2-pheny-lindole，DAPI)的染液，避光孵育15 min，對細胞核進行復染，PBS洗4次，每次5 min，用含抗熒光淬滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組BMSCs內紅色熒光表達，并用Image J pro plus 6.0軟件分析各組BMSCs紅色熒光標記的MOD。

2.6 MTT法檢測BMSCs增殖率 將MTT溶于PBS，配成質量濃度為5 mg/mL的溶液。收集各組BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單細胞懸液，細胞培養液調整其密度為1×105/mL，取100 μL接種于96孔板中，每組細胞設3個復孔，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中分別培養1、2、3、4、5、6、7 d后，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中繼續培養4 h后，棄去多余MTT和培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min，酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定吸光度A，計算細胞增殖率，公式為細胞增殖率=[(A實驗組-A空白孔)/(A空白組-A空白孔)]×100%。

2.7 Transwell檢測BMSCs侵襲及遷移 4 ℃下將Matrigel基質膠與預冷的無血清培養基按1∶8比例稀釋，取50 μL均勻鋪于Transwell小室上室，在37 ℃培養箱中過夜凝固，每組設3個平行孔，上室加入無血清培養基重懸的密度為2×105/mL的BMSCs細胞懸液150 μL，下室24孔板加入600 μL無外泌體血清培養基，在5% CO2、37 ℃培養箱中孵育24 h后取出Transwell小室，吸棄培養基，棉簽擦去上室殘留細胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色30 min，在100倍視野下觀察拍照，顯微鏡下隨機5個視野，計數并評價細胞侵襲能力。遷移實驗在Transwell小室腔膜上不鋪Matrigel基質膠，其余步驟同侵襲實驗。

2.8 Western blot檢測BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達 收集各組BMSCs，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，100 ℃變性10 min，得到蛋白樣品，80 V電泳跑過濃縮膠后電壓轉為120 V，將電流調整至恒流200 mA后轉移2 h，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，封閉液將一抗(Shh、Ptch1、Smo、c-Myc、Gli1)按1∶500稀釋，內參一抗β-actin按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，用封閉液將二抗按1∶1 000稀釋，室溫孵育1.5 h，TBST洗4次。將ECL曝光液覆蓋在整片膜上反應2 min，采用凝膠圖像處理系統軟件測灰度值，計算蛋白相對表達。

3 結果

3.1 NCI-N87外泌體鑒定 由圖1可見，NCI-N87外泌體有完整的雙層包膜，形成呈橢圓或碟狀的囊泡結構，內含低密度物質，粒徑介于40～80 nm之間(黃色箭頭)。外泌體特征性相關蛋白表達分別為CD9的86.47±3.25、CD63的93.82±5.95，高于胃癌細胞的49.15±6.53、77.00±2.56(P<0.05)；鈣網蛋白(calreticulin)未見明顯表達，但在NCI-N87細胞中有明顯表達，提示獲得了NCI-N87外泌體，符合后續實驗要求。

圖1 NCI-N87外泌體的鑒定Fig.1 Identification of exosomes in NCI-N87 cells

3.2 BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取 由圖2可見，與空白組比較，模型組BMSCs內可見大量紅色熒光標記，MOD值(25.16±2.38)升高(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs內紅色熒光標記減弱，MOD值分別為16.34±3.29、18.97±2.13、24.89±1.25，以高劑量組更明顯(P<0.05)；Shh阻斷劑組BMSCs內紅色熒光標記減弱，MOD值(9.22±0.76)降低(P<0.05)。

圖2 各組BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取(DAPI染色，×400)Fig.2 Uptakes of NCI-N87 cells exosomes by BMSCs in various groups(DAPI staining，×400)

3.3 BMSCs形態變化 由圖3可見，空白組BMSCs呈短平長梭形，有序均勻排列，似成纖維細胞樣生長，有明顯的折光性；模型組BMSCs呈集落樣團狀生長，細胞排列紊亂，細胞間連接疏松，與人胃癌NCI-N87細胞形態有相似之處；經半夏瀉心湯低、中、高劑量含藥血清干預后大部分細胞呈梭形，偶見團狀生長，但凋亡細胞增多。

3.4 BMSCs增殖率 由表1可見，從第3天開始，模型組相同時間點BMSCs增殖率高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs的增殖率均降低(P<0.05)，以高劑量組在4、5、6、7 d更明顯(P<0.05)。

圖3 各組BMSCs形態變化(×100)Fig.3 Morphological changes of BMSCs in various groups (×100)

表1 各組BMSCs增殖率

3.5 BMSCs侵襲及遷移 由圖4～5、表2可見，模型組BMSCs穿過Transwell小室濾過膜的細胞數量高于空白組(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs穿過Transwell小室濾過膜的細胞數量減少(P<0.05)，以高劑量組更明顯(P<0.05)。

圖4 各組BMSCs遷移能力(×100)Fig.4 Migration ability of BMSCs in various groups (×100)

圖5 各組BMSCs侵襲能力(×100)Fig.5 Invasion ability of BMSCs in various groups (×100)

3.6 BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc的蛋白表達 由表3、圖6可見，與空白組比較，模型組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達降低(P<0.05)，以高劑量組更明顯(P<0.05)。

表2 各組BMSCs穿膜細胞數

4 討論

BMSCs被認為是胃癌細胞的起源之一[17]，在前期階段能夠靶向遷移至胃黏膜的受損位置，參與損傷修復，而在后期階段其失控性增殖產生癌腫[18]。臨床胃癌組織及裸鼠體內致瘤組織分離得到胃癌細胞時，其生物學特性與BMSCs相似[19]。進一步研究顯示，處于胃癌微環境中的BMSCs，其基因表達、分化能力、擴增潛能和免疫表型等生物學特性已發生改變來適應腫瘤微環境[20]。

表3 各組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達

注：A為空白組，B為模型組，C為半夏瀉心湯低劑量組，D為半夏瀉心湯中劑量組，E為半夏瀉心湯高劑量組，F為Shh阻斷劑組。圖6 各組BMSCs中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、c-Myc蛋白表達Fig.6 Protein expressions of Shh, Ptch1, Smo, Gli1 and c-Myc of BMSCs in various groups

腫瘤微環境是由腫瘤細胞、基質細胞(間充質干細胞、成纖維細胞等)、細胞外基質及生長因子、細胞因子、其他小分子等共同構成的一個復雜的動態環境系統[21]。研究表明，腫瘤微環境中非腫瘤細胞在調控腫瘤發生發展及侵襲轉移中起關鍵作用[22]，BMSCs是構成腫瘤微環境重要的非腫瘤細胞成分之一[23]。腫瘤外泌體參與腫瘤微環境的調控，其富集、包裹了多種生物信息物質，被腫瘤微環境中的非腫瘤細胞攝取后能夠激活胞內信號通路對受體細胞進行多途徑、多位點的精細調節，在促進非腫瘤細胞增殖惡化方面具有重要作用[24]。

c-Myc是Shh信號通路核轉錄因子蛋白Gli的下游8號染色體癌基因[25]，為癌癥相關細胞過度增殖更明顯的標志之一[26]，在激活端粒酶活性、促進BMSCs惡性轉化方面發揮著重要作用[27]。Shh通路由分泌型信號糖蛋白Sonic hedgehog配體(Shh)、12次跨膜受體蛋白Patched1(Ptch1)、G蛋白偶聯受體樣蛋白Smoothened(Smo)及下游核轉錄因子蛋白Gli(Gli1、Gli2、Gli3，主要為Gli1)組成，Shh與Ptch1結合使Ptch1與Smo脫離，Smo活化后激活Gli，Gli進入細胞核調控靶基因的轉錄[28]。通過激活Shh信號通路下游的關鍵分子Gli1，可促進BMSCs生長增殖與分化[29]。

本研究結果表明，NCI-N87外泌體能夠被正常BMSCs攝取，BMSCs細胞形態發生變化，增殖、遷移能力明顯增強，有惡性轉化的趨勢。半夏瀉心湯含藥血清能夠抑制BMSCs對NCI-N87外泌體的攝取，經半夏瀉心湯干預后，BMSCs呈梭型生長，凋亡增多，增殖及侵襲能力均降低，同時發現BMSCs細胞內Shh信號通路相關蛋白Shh、Ptch1、Smo、Gli1及c-Myc表達下降，表明半夏瀉心湯含藥血清阻抑胃癌細胞來源外泌體誘發的BMSCs惡性轉化，其機制與抑制Shh信號通路與下游信號分子c-Myc蛋白的表達有關。