UPLC法同時測定雙黃升白復方中11種成分

覃艷虹， 江 旻， 張 彤,2， 許陳思涵， 楊 駿， 丁 越,2*

(1.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203；2.上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201203；3.上海市黃浦區香山中醫醫院藥劑科，上海 200020)

骨髓抑制是多數化療藥的常見毒性反應，常導致化療中斷或并發感染[1-3]。雙黃升白復方為龍華醫院治療化療后髓抑制的經驗方[4]，可促進造血干細胞增殖，改善骨髓造血微環境[5-7]，由黃芪、黃精、女貞子、天花粉、骨碎補、淫羊藿組成, 功效益氣養陰、補腎生髓[8-9]。方中黃芪具有多種活性成分，如黃芪甲苷、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等[10]，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷為主要代表[11]；黃精主要成分為黃精多糖，具有調節血糖血脂、增強免疫力等功效[12]；女貞子主要的苯乙醇類成分為紅景天苷[13]，并且2020年版《中國藥典》規定其含量不得低于0.7%[14]；骨碎補主要成分包括柚皮苷、新北美圣草苷等，其中柚皮苷為2020年版《中國藥典》規定檢測成分[15]，具有抗氧化、清除自由基等藥理作用[16]；天花粉主要成分為多種氨基酸[17]；淫羊藿中總黃酮醇苷具有促進造血功能、強化免疫等功效[18]，2020年版《中國藥典》規定其含量不得低于1.5%。

目前，對雙黃升白復方主要成分含量測定的報道較少，僅石秀峰等[19]通過測定淫羊藿苷(HPLC法)、黃芪甲苷(紫外法)含量來比較顆粒2種純化工藝，但以上2種成分需分別檢測，耗時較長。本實驗采用UPLC法同時測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素的含量，以期為該制劑全面質量控制提供技術支撐。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 series超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；BS124S電子天平(德國賽多利斯公司)；XS105DU電子天平[梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 特女貞苷(批號200006-202001，純度98.7%)、新北美圣草苷(批號240079-202006，純度98.2%)、朝藿定A(批號030050-202006，純度99.2%)、朝藿定B(批號260078-202006，純度98.6%)、朝藿定C(批號030049-201912，純度98.2%)對照品均購自上海鴻永生物科技有限公司；寶霍苷Ⅰ(批號R11M8F31212，純度98.3%)、紅景天苷(批號N26A11X111127，純度98.2%)、淫羊藿苷(批號Z11D5B1，純度98.6%)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號Y27F9H54731，純度99.9%)、柚皮苷(批號H24N9Z75896，純度98.9%)、芒柄花黃素(批號H06S9Z69494，純度99.9%)對照品均購自于上海源葉生物科技有限公司。黃芪(批號200915，產地甘肅)、黃精(批號200711，產地湖南)、女貞子(批號200908，產地湖南)、骨碎補(批號190422，產地廣東)、天花粉(批號200718，產地河南)、淫羊藿(批號200928，產地陜西)均由上?？禈蛑兴庯嬈邢薰咎峁?，經上海中醫藥大學教學實驗中心丁越研究員鑒定為正品。95%乙醇(分析純，批號20200812，國藥集團化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純[中國醫藥(集團)上?；瘜W試劑公司]。

2 方法和結果

2.1 提取液制備

2.1.1 醇提液 取6味組方藥材共150 g(生藥量)，加10倍量55%乙醇回流提取3次，每次1 h，回收乙醇，濃縮至1∶1，即得。

2.1.2 水提液 按照處方，取生黃芪、黃精等6味藥材共150 g(生藥量)，10倍量水煎煮3次，合并水提液，過濾后濃縮至1∶1，即得。

2.1.3 水提醇沉液 量取50 mL水煎提取濃縮液，加無水乙醇調至醇體積分數為80%，密封，冷藏24 h后取出，濾過，濾液濃縮，80%乙醇定容至50 mL量瓶中，即得。

2.1.4 陰性樣品 按照處方，分別制得缺黃芪、缺骨碎補、缺女貞子、缺淫羊藿的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 供試品溶液制備 精密吸取濃縮液1 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇混勻、定容，進樣前用0.2 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.086 mg/mL、朝藿定A 0.095 mg/mL、朝藿定B 0.480 mg/mL、朝藿定C 0.204 mg/mL、淫羊藿苷0.756 mg/mL、寶霍苷Ⅰ 0.044 mg/mL、紅景天苷0.943 mg/mL、新北美圣草苷0.535 mg/mL、柚皮苷1.122 mg/mL、特女貞苷0.952 mg/mL、芒柄花黃素0.003 5 mg/mL的溶液(已按其純度折算)，即得，室溫避光保存。

2.4 色譜條件 Aglient Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；流動相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.3 mL/min；不設柱溫；檢測波長270 nm(毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ)、280 nm(紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷)、254 nm(特女貞苷、芒柄花黃素)；進樣量2 μL。

2.5 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品溶液適量，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1～3。由此可知，各成分色譜峰分離度均大于1.5，附近無其他雜質峰干擾，表明該方法專屬性良好。

表1 梯度洗脫程序

1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 2.朝藿定A 3.朝藿定B 4.朝藿定C5.淫羊藿苷 6.寶霍苷Ⅰ 1.calycosin-7-glucoside 2.epimedin A 3.epimedin B 4.epimedin C 5. icariin 6.baohuoside I圖1 各成分UPLC色譜圖(270 nm)Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents (270 nm)

7.紅景天苷 8.新北美圣草苷 9.柚皮苷7.salidroside 8.neoeriocitrin 9.naringin圖2 各成分UPLC色譜圖(280 nm)Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents (280 nm)

10.特女貞苷 11.芒柄花黃素10.nuezhenide 11.formononetin圖3 各成分UPLC色譜圖(254 nm)Fig.3 UPLC chromatograms of various constituents (254 nm)

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 取“2.3”項下對照品溶液，50%甲醇稀釋，在“2.4”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，信噪比(S/N)3、10分別為最低檢測限、最低定量限，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.6.2 精密度試驗 取高、中、低質量濃度對照品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定6次，連續3 d，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素日內精密度RSD分別為0.1%～2.3%、0.1%～3.1%、0.1%～1.1%、0.1%～3.0%、0.1%～1.3%、0.1%～2.8%、0.1%～2.4%、0.2%～2.3%、0.1%～1.6%、0.3%～1.5%、0.2%～6.8%，日間精密度RSD分別為0.3%～1.8%、0.6%～3.5%、0.7%～4.5%、0.7%～3.6%、0.6%～4.1%、3.1%～3.6%、0.4%～3.4%、3.0%～1.2%、0.5%～4.2%、0.9%～4.4%、0.4%～4.2%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩定性試驗 取水提濃縮液適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素峰面積RSD分別為1.5%、1.0%、1.1%、0.2%、0.3%、0.8%、0.5%、0.6%、0.8%、2.2%、3.0%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.6.4 重復性試驗 精密吸取水提濃縮液1 mL，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素含量RSD分別為0.4%、0.6%、1.5%、1.4%、1.2%、2.7%、1.0%、0.8%、1.1%、0.5%、4.9%，表明該方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密移取各成分含量已知的水提濃縮液9份，每份0.5 mL，分別加入80%、100%、120%水平對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素平均加樣回收率分別為102.41%、102.99%、104.21%、102.51%、103.85%、102.90%、104.24%、99.25%、102.16%、104.01%、102.57%，RSD分別為1.0%、0.4%、1.4%、1.4%、0.8%、0.8%、0.6%、0.7%、0.5%、0.7%、0.7%。

2.7 樣品含量測定 取3種提取方法所得濃縮液適量，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，計算含量，再采用t檢驗進行統計學分析，結果見表3。

表2 各成分線性關系

3 討論

3.1 檢測指標篩選 黃芪主要有效成分為黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷，2020年版《中國藥典》規定，前者含量不得低于0.080%，本實驗先選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷。黃精、天花粉有效成分分別為多糖、氨基酸，兩者紫外檢測前均需進行衍生化，而且方法不同，故今后將對其質量評價方法進行改進；特女貞苷、紅景天苷、寶霍苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、柚皮苷為2020年版《中國藥典》中女貞子、淫羊藿、骨碎補的質量控制指標，故本實驗重點考察以上8種成分。此外，雙黃升白復方中芒柄花黃素、新北美圣草苷含量較高，故將兩者也納入檢測指標。

表3 各成分含量測定結果

3.2 色譜條件篩選 本實驗先采用二極管陣列檢測器(DAD)，在200～600 nm波長處進行掃描，并結合 2020年版《中國藥典》，最終確定為270、280、254 nm。再比較水-甲醇、水-乙腈洗脫時色譜分離情況，發現后者分離度更高，峰對稱度更好，故選擇其作為流動相。然后考察了不同體積流量(0.2、0.25、0.3、0.4 mL/min)、柱溫(25、30、35 ℃)對色譜峰峰形、分離度、基線的影響，發現不同柱溫均無明顯影響，最終確定體積流量為0.3 mL/min，不設柱溫，進樣量為2 μL。

3.3 不同提取液中各成分含量比較 朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷是雙黃升白復方水提液、醇提液主要成分，并且前者中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、新北美圣草苷含量分別為后者中的1.2、1.4、1.2倍，而后者中寶霍苷Ⅰ、特女g貞苷含量分別為前者中的1.5、1.5倍。另外，該方水提醇沉液澄清度明顯提高，但各成分含量均降低。

4 結論

本實驗建立UPLC法同時測定雙黃升白復方中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶霍苷Ⅰ、紅景天苷、新北美圣草苷、柚皮苷、特女貞苷、芒柄花黃素的含量，通過方法學考察發現該方法精密度、重復性、穩定性均良好，符合中藥分析要求。今后，將采用UPLC法進一步考察雙黃升白復方新藥生產的制備工藝。