HPLC法同時(shí)測(cè)定強(qiáng)力定眩片中13種成分

羅歡歡， 馮澤宇， 李 捷， 謝艷華， 田慧玲， 肖會(huì)敏， 王四旺*， 李志平

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710069；2.陜西漢王藥業(yè)有限公司，陜西 漢中 723000；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)中藥與天然藥物教研室，陜西 西安 710032)

強(qiáng)力定眩片是陜西漢王藥業(yè)有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的復(fù)方制劑，由天麻、杜仲、杜仲葉、野菊花、川芎組成，主治高血壓、高脂血癥、眩暈，臨床療效顯著[1-4]。中藥(尤其是復(fù)方)組成復(fù)雜，多成分定量分析能更全面客觀地評(píng)價(jià)其質(zhì)量[5-7]，但文獻(xiàn)[8-12]僅以天麻素為強(qiáng)力定眩片質(zhì)控指標(biāo)，只有王媚[13]采用UPLC-ESI-MS/MS法同時(shí)測(cè)定其中7種成分含量。

2015、2020年版《中國(guó)藥典》將天麻素和對(duì)羥基苯甲醇、松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、蒙花苷分別作為天麻、杜仲、杜仲葉、野菊花指標(biāo)成分，藁本內(nèi)酯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腦缺血等藥理作用[14]，沒(méi)食子酸具有降血壓作用[15]，5-羥甲基糠醛具有改善學(xué)習(xí)記憶、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等藥理作用[16]，綠原酸具有保護(hù)心血管作用[17-18]。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定強(qiáng)力定眩片中天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、對(duì)羥基苯甲醇、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、巴利森苷C、巴利森苷A、藁本內(nèi)酯、蒙花苷的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供理論和技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器 LC-2010CHT高效液相色譜儀(日本島津公司)；BSA2202S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；Milli-Q Integral 5超純水一體化系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)；KQ-500E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 強(qiáng)力定眩片10批，批號(hào)(編號(hào))分別為017101(S1)、024102(S2)、016101(S3)、023102(S4)、027102(S5)、019101(S6)、021101(S7)、026102(S8)、028102(S9)、007101(S10)，由陜西漢王藥業(yè)股份有限公司提供。天麻素(批號(hào)HR16313B1，純度≥98.0%)、5-羥甲基糠醛(批號(hào)HH248894198，純度≥98.0%)、對(duì)羥基苯甲醇(批號(hào)H21D6Q7813，純度≥98.0%)、新綠原酸(批號(hào)HR20422B1，純度≥98.0%)、隱綠原酸(批號(hào)HR20423B1，純度≥98.0%)、巴利森苷B(批號(hào)HR2098B1，純度≥98.0%)巴利森苷C(批號(hào)HS20905B1，純度≥98.0%)，巴利森苷A(批號(hào)HS11129W4,純度≥98.0%)、松脂醇二葡萄糖苷(批號(hào)HS0870W2，純度≥98.0%)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)HL09355198，純度≥98.0%)對(duì)照品均購(gòu)自寶雞辰光生物科技有限公司；綠原酸(批號(hào)110753-201415，純度≥96.20%)、蒙花苷(批號(hào)111528-201300，純度≥95.1%)、沒(méi)食子酸(批號(hào)110831-201906，純度≥91.5%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Lamdo Stamsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.05%磷酸(B)，梯度洗脫(0～2 min，3%～7%A；2～20 min，7%A；20～30 min，7%～12%A；30～90 min，12%～30%A；90～100 min，30%～50%A)；體積流量0.7 mL/min；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220、280 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 供試品溶液制備 取本品10片，去薄膜衣，研細(xì)，精密稱取約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，甲醇制成每1 mL分別含天麻素212.50 μg、沒(méi)食子酸233.00 μg、5-羥甲基糠醛136.50 μg、對(duì)羥基苯甲醇208.00 μg、新綠原酸493.00 μg、綠原酸224.50 μg、隱綠原酸227.50 μg、巴利森苷B 125.00 μg、松脂醇二葡萄糖苷122.00 μg、巴利森苷C 160.50 μg、巴利森苷A 154.00 μg、藁本內(nèi)酯2 225.00 μg、蒙花苷234 μg的溶液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照本品處方，分別制得缺天麻、缺杜仲、缺杜仲葉、缺野菊花、缺川芎的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，對(duì)照品、供試品溶液在相應(yīng)位置處有相同色譜峰，各成分色譜峰分離度均大于1.5，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，稀釋成6個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、對(duì)羥基苯甲醇、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、巴利森苷C、巴利森苷A、藁本內(nèi)酯、蒙花苷峰面積RSD分別為2.03%、1.05%、1.21%、1.15%、1.26%、1.66%、0.70%、1.32%、1.29%、0.98%、1.91%、1.94%、1.64%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取本品(批號(hào)007101)6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣下測(cè)定，測(cè)得天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、對(duì)羥基苯甲醇、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、巴利森苷C、巴利森苷A、藁本內(nèi)酯、蒙花苷峰面積RSD分別為1.26%、1.62%、1.90%、1.90%、1.27%、2.12%、1.80%、2.20%、2.11%、1.70% 1.99%、1.60%、1.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

注：a～g分別為對(duì)照品、供試品、缺天麻陰性樣品、缺杜仲陰性樣品、缺杜仲葉陰性樣品、缺野菊花陰性樣品、缺川芎陰性樣品。1.天麻素 2.沒(méi)食子酸 3.5-羥甲基糠醛 4.對(duì)羥基苯甲醇 5.新綠原酸 6.綠原酸 7.隱綠原酸 8.巴利森苷B9.松脂醇二葡萄糖苷 10. 巴利森苷C 11. 巴利森苷A 12.藁本內(nèi)酯 13.蒙花苷1.gastrodia elata 2.gallic acid 3.5-hydroxymethyl furfural 4. para-hydroxybenzyl alcohol 5. neochlorogenic acid 6.chlorogenic acid 7. cryptochlorogenic acid 8. parisin B 9. pinolinol diglucoside 10. parisin C 11. parisin A 12. ligustilide 13. linarin圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、對(duì)羥基苯甲醇、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、巴利森苷C、巴利森苷A、藁本內(nèi)酯、蒙花苷峰面積RSD分別為2.01%、1.56%、1.55%、1.08%、2.24%、2.29%、1.20%、1.31%、1.99%、2.00%、2.30%、2.96%、2.42%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(批號(hào)007101)約0.25 g，共6份，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、對(duì)羥基苯甲醇、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、巴利森苷C、巴利森苷A、藁本內(nèi)酯、蒙花苷平均加樣回收率分別為102.43%、104.79%、97.91%、99.43%、104.99%、101.66%、102.75%、97.34%、98.64%、100.70%、100.79%、105.29%、102.69%，RSD分別為2.07%、0.70%、1.97%、2.34%、0.64%、2.26%、2.22%、0.67%、1.70%、1.96%、2.88%、2.62%、1.49%。

2.11 樣品含量測(cè)定 取本品10批，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.12 聚類分析 采用SPSS 26.0軟件中的組間連接聚類，以歐氏距離為測(cè)度，對(duì)10批樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，當(dāng)類間距離為10時(shí)，10批樣品可聚為2類，S3、S7、S5、S1、S8、S6為第Ι類，S4、S10、S2、S9為第Ⅱ類，可能與原藥材產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采收季節(jié)、加工炮制方式等有關(guān)。

2.13 主成分分析 采用SPSS 26.0軟件對(duì)10批樣品進(jìn)行主成分分析，以累積方差貢獻(xiàn)率>85%、初始特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)前3個(gè)主成分初始特征值分別為6.673、2.632、2.038，均大于1；方差貢獻(xiàn)率分別為51.331%、20.244%、15.674%，總貢獻(xiàn)率為87.249%，大于85%，碎石圖見(jiàn)圖3，載荷矩陣見(jiàn)表3。由此可知，巴利森苷C、新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蒙花苷、巴利森苷B、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A對(duì)主成分1貢獻(xiàn)率高，沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、天麻素、藁本內(nèi)酯對(duì)主成分2貢獻(xiàn)率高，松脂醇二葡萄糖苷對(duì)主成分3貢獻(xiàn)率高。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=3)

圖2 10批樣品聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis diagram for ten batches of samples

圖3 各成分碎石圖Fig.3 Scree plot for various constituents

2.14 質(zhì)量評(píng)價(jià) 分別以F1、F2、F3代表3種主成分，作為10批樣品所含13種成分(X1～X13)的信息，并建立線性表達(dá)式，即F1=0.13X1+0.147X2-0.135X3+0.314X4+0.357X5+0.336X6+0.355X7+0.314X8+0.244X9+0.377X10+0.26X11+0.077X12-0.324X13、F2=0.396X1+0.534X2+0.488X3-0.207X4+0.087X5+0.148X6+0.105X7-0.185X8-0.19X9-0.074X10-0.24X11+0.268X12-0.177X13、F3=0.268X1+0.043X2+0.273X3-0.228X4-0.245X5-0.264X6-0.24X7+0.35X8+0.485X9+0.067X10+0.412X11+0.238X12+0.155X13，將其與所對(duì)應(yīng)主成分的方差貢獻(xiàn)率相乘后，再除以累積貢獻(xiàn)率，計(jì)算綜合評(píng)分Y，表達(dá)式為Y=(F1×51.331+F2×20.244+F3×15.674)/87.249，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，樣品S5(批號(hào)027102)質(zhì)量最優(yōu)，其次是S3(批號(hào)016101)、S7(批號(hào)021101)，S2(批號(hào)024102)、S9(批號(hào)028102)質(zhì)量較差。

表3 初始因子載荷矩陣

3 討論

3.1 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)以各成分分離度、保留時(shí)間、峰形為指標(biāo)，比較了不同流動(dòng)相[甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(含1%磷酸)、甲醇-水(含0.05%磷酸)、乙腈-水(含1%磷酸)、乙腈-0.05%磷酸、甲醇-水(含1%乙酸)、甲醇-水(含0.05%乙酸)]、色譜柱(Inertsil C18、Kromasil 100-5C18、Diamonsil C18、Lamdo Stamsil C18)、柱溫(20、25、30、35 ℃)、體積流量(0.6、0.7、0.8、1.0 mL /min)，最終分別確定為乙腈-0.05%磷酸、Lamdo Stamsil C18色譜柱、柱溫20 ℃、體積流量0.7 mL/min。在190～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)天麻素、對(duì)羥基苯甲醇和巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷A最大吸收波長(zhǎng)分別為221、223、222 nm，故在220 nm下檢測(cè)；沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、藁本內(nèi)酯、蒙花苷、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸最大吸收波長(zhǎng)分別為272、283、277、333、324、324、324 nm，但新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸在324 nm處峰形較差，而上述7種成分在280 nm處均有較好的靈敏度，雜質(zhì)峰干擾較小，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)；松脂醇二葡萄糖苷在220 nm波長(zhǎng)處的峰型優(yōu)于280 nm波長(zhǎng)處，故確定為220 nm。

表4 10批樣品綜合評(píng)分

3.2 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)首先考察了提取溶劑水、甲醇、乙醇，發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果較好，再考察了體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%，發(fā)現(xiàn)50%時(shí)提取率較高，峰面積較大，各成分色譜峰與雜質(zhì)均能達(dá)到基線分離。然后，考察了加熱回流、超聲提取，發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯等成分受熱不穩(wěn)定，故選擇超聲提取[19-20]。最后，考察了提取時(shí)間15、30、45 min，發(fā)現(xiàn)提取30 min時(shí)提取率高于提取15 min時(shí)，而提取30、45 min時(shí)無(wú)明顯區(qū)別，故確定為30 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定強(qiáng)力定眩片中天麻素、沒(méi)食子酸、5-羥甲基糠醛、對(duì)羥基苯甲醇、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、巴利森苷B、松脂醇二葡萄糖苷、巴利森苷C、巴利森苷A、藁本內(nèi)酯、蒙花苷的含量，該方法快速準(zhǔn)確，高效靈敏，專屬性強(qiáng)，可為該制劑質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。