利用沉積物和水體的環境DNA檢測魚類物種多樣性的差異

周春花，鐘偉翔，陳金萍，歐陽珊,b，吳小平,b*

(南昌大學a.生命科學學院；b.鄱陽湖環境與資源利用教育部重點實驗室，江西 南昌 330031)

人為活動對于全球生物多樣性具有廣泛影響，并可能對生態系統服務和功能產生負面影響[1]。淡水生態系統中生物多樣性喪失的速度越來越快，超過了陸地或海洋環境[2]。這使得人們迫切需要開發監測工具，以快速、準確地監測淡水生態系統中的生物群落組成。現有的生物多樣性調查技術(網捕)因其方法上的局限性(例如，觀察者偏見、對物種的二次傷害)而受到批評[3]。一種可能克服上述一些局限性的方法是使用在環境樣本(例如水、土壤或沉積物)中發現的DNA來推斷生態系統中的生物體是否存在[4]。這種被稱為環境DNA(environmental DNA,eDNA)的遺傳物質是組織、細胞、亞細胞碎片和在生物正常生活和死亡過程中丟失到環境中的胞外DNA的多聚分散混合物[5]。環境DNA調查已用于通過qPCR分析進行目標檢測(即單一物種)，以及用于使用宏條形碼技術的群落(即多物種)研究[6-7]。近年來，環境DNA宏條形碼已被廣泛運用于淡水生態系統的漁業管理與多樣性監測中[8]。在美國上百個池塘、小溪、河流的生物多樣性調查中發現多種兩棲動物、魚類、哺乳動物、昆蟲和甲殼類動物[9]。通過使用多對魚類宏條形碼引物從水庫中檢測出了傳統方法監測到的所有魚類物種[10]。Zhang等對基于環境DNA技術系統研究了空間采樣設計對3個不同大小的湖泊的魚類群落結構的影響，結果支持岸邊采樣同樣有效[11]。這些調查非常敏感，一旦方法得到優化，就可以實現自動化[12]。然而，其有效性和可復制性依賴于恰當的實驗設計和對取樣、測序文庫制備和生物信息學分析過程中方法選擇的影響的理解[13]。雖然一致認為環境DNA調查信息豐富，可以補充其他生物多樣性監測方法[14]，但eDNA對不同環境樣本類型如何影響物種可檢測性的研究仍然很少[15]。

鄱陽湖為中國最大的淡水湖泊，是生物多樣性的熱點區[16]。近年來，圍湖造田、湖沙挖掘、攔河筑壩、圍堤養殖、過度捕撈等人類活動，嚴重影響鄱陽湖的生物多樣性(特別是魚類物種)。鄱陽湖生物多樣性與生態平衡問題受到國家和政府的密切關注，制定了相關的禁漁措施[17]。鄱陽湖生物多樣性保護與生態恢復迫切需要建立快速有效和環境友好的監測機制，為漁業管理以及生態保護政策的制定與實施提供科學依據。本研究運用環境DNA宏條形碼技術探討鄱陽湖不同的環境樣本類型如何影響物種的可檢測性，為進行環境DNA監測時取樣策略的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

本研究于2020年1月在鄱陽湖水域進行采樣，共設置10個采樣點。在每個采樣點用采水器采集1L上層水于無菌的可密封廣口瓶中，且每個樣點做3次重復采樣。用采泥器在采水樣的地點同時采集沉積物于30 mL無菌密封廣口瓶中，每個樣點做3次重復采樣。所有的樣品冰上保存。環境水樣于24 h之內用0.45 μm的混合纖維素酯膜濾膜及Rocker 300無油真空泵抽濾。每次過濾前后，均對實驗器材進行消毒清洗，避免交叉污染。每次過濾用蒸餾水做陰性對照，以評估外源DNA污染是否存在。在每份水樣過濾后，濾膜立即冷凍保存。

1.2 環境DNA提取及擴增

使用試劑盒DNeasy? Blood &Tissue Kit(Qiagen?)提取濾膜中的水樣環境DNA(步驟做了適當優化)。使用DNeasy? PowerSoil Kit(Qiagen?)提取沉積物DNA。每個樣點做的3次重復，合并DNA。用Qubit(Thermo Fisher Scientific)測試DNA濃度。利用線粒體細胞色素b簡并引物L14912-CYB：5’-TTCCTAGCCATACAYTAYAC-3’(Y=C或T)，下游引物H15149-CYB：5’-GGTGGCKCCTCAGAAGACATTTGKCCYCA-3’(K=G或T，Y=C或T)進行PCR擴增，產物大小約285 bp[18]。PCR反應體系為25 μL：5×buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol)2 μL,加標記的上、下游引物(10 uMol)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 13.75 μL，Q5 DNA Polymerase(2 U/μL)0.25 μL。PCR程序：98℃ 預變性2 min；98℃變性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30個循環；72℃再延伸5 min；10℃保存。每次PCR均設置陰性對照。每個樣本做3次重復PCR，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由上海派森諾生物科技股份有限公司進行高通量測序。

1.3 文庫構建、高通量測序、OUT劃分及注釋

對純化后的PCR產物用Qubit?3.0(Life Invitrogen)進行定量。測序使用Illumina MiSeq(2×300 bp)和MiSeq Reagent Kit v3按照說明來進行。測序策略為Mova-Seq-PE250。測序數據量為每個樣本的有效序列約6萬條。使用QIIME軟件將低質量的序列按照以下條件去除：(1)長度小于150 bp的序列，(2)平均Phred值<20的序列，(3)含有模糊堿基N的序列，(4)含有>8 bp的單核苷酸重復序列等。將獲得的高質量序列一致性大于97%的聚類為一個OTUs(operational taxonomic units,OTUs)，從每個OTU選擇一個代表性的，再用BLAST與GenBank進行比對，并分配給總分最高的分類單元。從GenBank中下載鄱陽湖流域的118種魚類線粒體基因組序列構建本地數據庫。將OTU代表序列比對到本地庫，設置比對參數E-value<10-12，identity≥97%，并綜合公司比對的結果。

1.4 數據分析

2 結果

2.1 物種組成分析

本研究通過對20個樣本(空白對照在PCR擴增中并未產生目的條帶，未進行高通量測序)采用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序，經質控處理后，共得到102萬條有效序列，平均長度270bp。按序列相似性≥97%聚類，得到892個OTU。本研究共注釋到魚類7目11科23種(表1)，其中沉積物樣本注釋到6目10科18種，水樣中注釋到5目7科13種。沉積物中注釋到的魚類物種數更多。水樣和沉積物環境DNA共同注釋到8種魚類(32%)，僅通過沉積物環境DNA注釋到10種魚類(43.48%)，僅通過水樣環境DNA注釋到5種魚類(27.14%)。本研究注釋到的魚以小型、湖泊定居型、雜食性魚類為主。沉積物樣本中注釋到的魚類有6種上層魚、1種下層魚和11種底層魚，水體樣本中注釋到的魚類有6種上層魚、3種下層魚和4種底層魚。

表1 環境DNA水樣及沉積物監測的鄱陽湖魚類物種

2.2 Alpha多樣性分析

Chao1指數，沉積物的平均值為4.6(變幅2～9)，水體的平均值為3.6(變幅為1～7)。Shannon-Weiner指數，沉積物的平均值為0.80(變幅為0.03～1.59)，水樣的平均值為0.50(變幅為0～1.31)。Simpson指數，沉積物的平均值0.29(變幅為0.01～0.59)，水樣的平均值為0.22(變幅為0～0.47)。Pielou指數，沉積物的平均值為0.59(變幅為0.04～1.07)，水樣的平均值為0.40(變幅為0～1.32)。由圖1可知，沉積物的4種多樣性指數均高于水樣的，但兩者之間無顯著性差異。

圖1 沉積物和水樣樣本注釋到魚類的多樣性指數

2.3 Beta多樣性分析

環境DNA方法沉積物與水樣在魚類群落相似性的NMDS排序在結構相似(stress=0.18)，由分析圖表明(圖2)，沉積物和水樣的樣本點距離較近，有重疊區域，通過Adonis分析表明，沉積物和水樣的環境DNA注釋到的魚類的群落結構沒有顯著性差異(R2=0.662，P=0.418)。

圖2 沉積物和水樣中鑒定的魚類群落NMDS排序

3 討論

本研究基于沉積物和水體環境DNA共注釋到鄱陽湖的23種魚中，鯉科魚類物種數最多(表1)，占比最高(43.5%)，這與傳統方法調查得出的結果一致[20]。本研究注釋到的魚按生態類型分，以湖泊定居型，這和楊少榮等得出的結果相類[27]。本研究基于環境DNA宏條形碼得出鄱陽湖以小型魚類為主，這和傳統方法研究結果相同[28]。本研究只檢測到了四大家魚中的鳙，而沒有檢測到青魚、草魚、鳊和鰱，原因可能與采樣的水層有關，鳙是中上層魚，青魚、草魚和鳊是中下層魚，而本研究只采了上層水；也可能與引物的通用性和高通量測序的數據量有關。本研究沒有對優勢魚類物種即序列數多的魚類進行討論，是因為PCR擴增過程中引物會有偏好性。很多研究表明PCR的偏好性是造成環境DNA對某些低豐度物種檢測不到和物種生物量估測錯誤的最主要因素[29]。現有環境DNA分析大多依賴PCR擴增，因此控制和減輕PCR的偏好性是環境DNA對生物多樣性監測的主要挑戰之一。此外，使用環境DNA濃度估計物種豐度并沒有那么簡單[30]。因為環境DNA在溪流和河流中隨水流順流而下的過程中可能會發生遷移、稀釋、滯留和再懸浮，這使得環境DNA濃度數據的解釋更加復雜[31]。一些研究發現環境DNA和生物量之間存在積極但微弱的關系[32]，而其他研究發現根本沒有關系[33]。

4 結論

本研究首次使用環境DNA宏條形碼技術評估了鄱陽湖不同的環境樣本類型如何影響魚類物種的可檢測性。沉積物樣本中檢測到的魚類的多樣性高于水體中的，在進行環境DNA調查時需要仔細考慮環境樣本類型。建議在使用環境DNA進行魚類資源研究時，取樣策略采取沉積物樣本和水體樣本相結合將會更有意義。中國政府曾經只在長江某些地區的春季魚類產卵季節禁止捕魚，但現在已經在長江的關鍵地區實施了為期10年的全面禁漁。因此，環境DNA宏條形碼以其采樣非侵入性且分辨率高的優勢逐漸地成為水生生物多樣性調查的重要補充工具。