甘草酸銨對過敏性紫癜性腎炎小鼠腎功能及IL-23/STAT3通路的影響

趙利平，梁衛章，張俊民，代寶春，姜紅，劉秀珍

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)也稱免疫球蛋白A血管炎(IgAV)，是一種系統性血管炎，其特征是IgA免疫復合物沉積在皮膚和其他器官(如胃腸道、關節、腎)[1]。腎臟受累于IgAV，稱為過敏性紫癜性腎炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN)，是最常見、最嚴重的并發癥，也是影響HSP患者長期預后的主要因素[2]。據統計，嬰兒中HSP的發生率是成人的2～33倍，超過90%的病例<10歲，約有40%的HSP兒童發生腎臟受累，甚至發展成晚期腎病[3]。迄今為止，HSPN的發病機制尚未完全闡明，通常認為HSPN與異常的免疫功能有關。既往已有大量研究證實，輔助性T細胞(Th)1/Th2、Th17/調節性T細胞(Treg)免疫失衡在HSPN發病機制中占據重要地位，而Th17細胞特征的穩定和維持主要通過白介素-23(IL-23)來實現[4]。不少研究發現在HSPN患兒血清中IL-23明顯高于健康兒童[5]。甘草酸銨具有抗炎、抗氧化、調節免疫、抗病毒、肝臟保護和抗癌活性，已在臨床上用于治療免疫介導的肝損傷，可調節免疫細胞(Th1、Th2、Th17和Treg)的平衡，抑制肝細胞凋亡[6-8]。另有研究發現，甘草為臨床上中藥復方治療過敏性紫癜的常用藥，對急性腎損傷也有一定的保護作用，但是甘草酸銨對HSPN的作用機制及腎功能的影響尚不清楚[9-10]。因此，現建立HSPN小鼠模型，探討甘草酸銨對HSPN腎功能的影響，為HSPN的治療和甘草酸銨臨床更好的應用提供參考，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：雄性健康SPF級C57BL/6小鼠80只，6～8周齡，體質量(18～20)g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，于溫度為(24±2)℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替環境中飼養，自由飲水和攝食。動物使用的所有實驗程序均符合實驗動物的護理和使用指南，并已獲得醫院倫理委員會批準(批件號：L2020061902)。

1.1.2 藥物試劑：甘草酸銨(湖北西音和醫藥有限公司，原料藥，純度99.98%)，注射用環磷酰胺(江蘇盛迪醫藥有限公司)，小鼠尿蛋白檢測試劑盒(上海心語生物科技有限公司)，小鼠血清IL-23、IL-17、免疫球蛋白A(IgA)、循環免疫復合物(CIC)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，小鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)，小鼠外周血單個核細胞分離液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗鼠IL-23抗體、信號傳導和轉錄激活因子3(STAT3)抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體、羊抗兔二抗(英國Abcam公司)。

1.1.3 儀器設備：iMark680型多功能酶標儀、FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀(美國Bio-Rad公司)，BX51型顯微鏡(日本Olympus公司)，WD-9413A型凝膠成像系統(撫州金時速儀器設備有限公司)。

1.2 實驗方法 2020年7月—2021年1月在邯鄲市中心醫院實驗室進行實驗，80只小鼠飼養1周后，隨機選取12只作為空白對照組，其余小鼠參照文獻[11]方法采用BSA、LPS和CCl4建立HSPN模型：除空白對照組外，其余小鼠予BSA 4 ml/kg 灌胃，1次/2 d，持續8周；皮下注射CCl4(蓖麻油0.3 ml + CCl40.1 ml)，1次/周，持續9周；并在第6、8、10和12周時尾靜脈注入 LPS(0.025%)0.2 ml，建立IgA腎病模型；從第9周開始，25%生姜水10 ml/kg灌服，1次/2 d；在建模期間將室溫調節至30℃，構建血熱證模型，復合成為HSPN模型?？瞻讓φ战M小鼠給予等量生理鹽水灌胃，等量生理鹽水尾靜脈注射和皮下注射。在第12周結束時隨機選取6只模型小鼠檢驗模型是否成功。模型成功標準：皮下出現紫癜，顯微鏡下可見局灶性上皮細胞增多和炎性細胞浸潤，腎臟發生病理改變。在造模過程中小鼠死亡2只。

將造模成功的小鼠60只按隨機數字表法分為模型組、環磷酰胺組(22 mg/kg)[12]及甘草酸銨低、中、高劑量組(25、50、100 mg/kg)[13]，每組12只。環磷酰胺組、甘草酸銨各劑量組小鼠從第13周開始，腹腔注射相應劑量的藥物，1次/d；空白對照組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，共給藥4周。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 尿蛋白及尿紅細胞測定：給藥結束后，收集各組小鼠24 h尿液，采用尿蛋白檢測試劑盒測定24 h尿蛋白水平，尿沉渣計數法測定尿液紅細胞計數。

1.3.2 血清IL-23、IL-17、IgA、BUN、SCr、CIC水平測定：收集尿液完成后，首先使用毛細管在眼眶靜脈叢采集小鼠外周血0.2 ml備用，然后采用摘眼球取血的方法取血0.5 ml，將0.5 ml血液分離血清，ELISA法檢測血清中IL-23、IL-17、IgA、BUN、SCr、CIC水平。

1.3.3 小鼠外周血單個核細胞中Th17及Treg細胞比例測定：取1.3.2中采集的0.2 ml外周血，按照小鼠外周血單個核細胞分離液試劑盒操作制備單個核細胞懸液，流式細胞術檢測外周血單個核細胞懸液中Th17及Treg分別占CD4+T細胞的百分比，并計算各組Th17/Treg細胞比值。

1.3.4 腎臟組織形態學變化：采血完成后，取小鼠雙側腎臟組織，一側腎臟組織液氮速凍后-80℃保存待測。另一側腎臟組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切成5 μm切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織的形態變化。

1.3.5 小鼠腎臟組織IL-23、p-STAT3、STAT3蛋白表達：取-80℃保存的腎臟組織，加入RIPA裂解液研磨后，于冰上靜置30 min充分裂解后離心，取上清液為總蛋白溶液，BCA法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(30 μg/孔)，聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應一抗(IL-23、p-STAT3、STAT3 按1∶1 000比例進行稀釋，β-actin按1∶5 000比例進行稀釋)于4℃下孵育過夜，加入羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，化學發光試劑顯色，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

2 結 果

2.1 各組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細胞計數比較 與空白對照組比較，模型組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細胞計數顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠24 h尿蛋白及環磷酰胺組、甘草酸銨中、高劑量組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細胞計數顯著降低(P<0.05)；與環磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細胞計數升高(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細胞計數差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細胞計數的比較

2.2 各組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr水平比較 與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr升高(P<0.05)；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、SCr及環磷酰胺組、甘草酸銨中、高劑量組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr降低(P<0.05)；與環磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr升高(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr水平比較

2.3 各組小鼠外周血單個核細胞中Th17、Treg及Th17/Treg細胞比值比較 與空白對照組比較，模型組小鼠外周血單個核細胞中Th17細胞占比、Th17/Treg細胞比值顯著升高，Treg細胞占比顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，環磷酰胺組及甘草酸銨低、中、高劑量組小鼠外周血單個核細胞中Th17細胞占比、Th17/Treg細胞比值顯著降低，Treg細胞占比顯著升高(P<0.05)；與環磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組外周血單個核細胞中Th17細胞占比、Th17/Treg細胞比值升高，Treg細胞占比降低(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠外周血單個核細胞中Th17、Treg及Th17/Treg細胞比值比較

2.4 各組小鼠腎臟組織病理學變化比較 HE染色結果顯示，空白對照組小鼠腎臟組織結構正常，未發生明顯病變；模型組小鼠出現腎小球囊性滲出、出血，腎小球基底膜增生，間質纖維化和腎小球硬化，也可見較多的炎性細胞浸潤；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠腎臟組織上述病理癥狀未見明顯改善，可見較多炎性細胞浸潤，環磷酰胺組和甘草酸銨中、高劑量組小鼠腎臟組織上述癥狀明顯減輕，可見少量炎性細胞浸潤，見圖1。

2.5 各組小鼠腎臟組織IL-23、p-STAT3、STAT3蛋白表達比較 與空白對照組比較，模型組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠腎臟組織中IL-23蛋白及環磷酰胺組、甘草酸銨中、高劑量組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與環磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠上述指標差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表4。

表4 各組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達比較

注：G.腎小球；黑色箭頭代表有出血；圓圈代表腎小球基底膜增厚；星號代表炎性細胞浸潤

圖2 各組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3、STAT3蛋白印跡圖

3 討 論

血尿和蛋白尿是HSPN患者腎臟受累的主要特征[14]。從無癥狀的微觀血尿到蛋白尿和各種程度的急性腎損傷，再到迅速進行性腎小球腎炎，一些兒童最終發展為慢性腎病或終末期腎病，對家庭和社會都是沉重的負擔。因此，研究HSPN的發病機制并給予合理的治療具有重要意義。

HSPN與免疫功能介導的炎性反應密切相關。既往已有研究證實，HSPN患兒外周血中Th17細胞的比例顯著增加，Th17細胞的異常活化與患者體內促炎因子的產生及血管炎的發展關系密切[15]。而IL-23是維持Th17細胞穩定的重要因子，可誘導Th17細胞分化，促進IL-17產生和釋放，介導機體炎性反應[16]。有研究發現，在HSPN患兒血清中IL-23明顯高于健康兒童，且Treg細胞比例顯著降低[5]。本研究結果顯示，HSPN小鼠血清中IL-23、IL-17水平及外周血單個核細胞中Th17/Treg細胞比值顯著高于正常小鼠，與上述結果一致；同時24 h尿蛋白水平、尿紅細胞計數和血清IgA、CIC、BUN、SCr水平均升高，提示體內Th17/Treg細胞比例的失衡，可能打破了機體正常的免疫狀態，引發一系列的免疫和炎性反應，導致腎組織損傷；再次證實IL-23可能在HSPN的發病過程中起重要作用。甘草酸銨是臨床常用的治療免疫性肝損傷的藥物，具有抗炎、調節免疫的作用，可調節免疫細胞Th17和Treg的平衡[17]。已有研究發現，復方甘草酸銨對過敏性紫癜有保護作用[18]。本研究結果顯示，給予甘草酸銨治療后，小鼠血清IL-23、IL-17和免疫功能、腎功能指標水平降低，外周血單個核細胞中Th17/Treg細胞比值降低，提示甘草酸銨可能通過調節HSPN小鼠Th17/Treg細胞免疫平衡，減輕HSPN小鼠腎損傷。

STAT3是Th17和Treg細胞分化的決定因素，在協調Th17細胞的穩態和致病性中起關鍵作用[19]。IL-23的功能主要通過STAT3信號通路實現，促炎細胞因子IL-6和IL-23的過度表達可誘導Th17細胞成熟分化，并刺激Treg細胞中的STAT3磷酸化，STAT3的過度磷酸化會通過下調信號傳導和轉錄激活因子5(STAT5)和叉頭框蛋白3(Foxp3)的表達損害Treg細胞的增殖和細胞因子分泌，而抑制STAT3的磷酸化則會恢復這些功能[20]。研究發現，STAT3基因多態性與過敏性紫癜易感性相關[21]；且STAT家族因子的表達，參與梗阻性腎病、糖尿病腎病、急性腎損傷等腎臟疾病的發生發展，抑制該信號通路有助于延緩疾病的進展[22]。在系統性硬化病中，抑制STAT3信號通路，可抑制Th17細胞的增殖[23]；在系統性紅斑狼瘡患者中，通過阻斷STAT3信號通路,可誘導Treg分化及抑制Th17分化,從而調控Th17/Treg平衡[24]。說明Th17和Treg細胞失衡與STAT3的異常表達有關。本研究發現，HSPN小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白水平均高于正常小鼠；給予甘草酸銨治療后，HSPN小鼠腎臟組織中IL-23和p-STAT3/STAT3蛋白表達水平均降低；提示甘草酸銨可下調IL-23的表達，抑制STAT3活化。鑒于以上研究結果，推測甘草酸銨可能通過IL-23/STAT3信號通路調節Th17/Treg細胞免疫平衡。

綜上所述，甘草酸銨對HSPN小鼠具有保護作用，可減輕HSPN小鼠腎損傷；其作用機制可能與抑制IL-23/STAT3通路的活化，調節HSPN小鼠Th17/Treg細胞免疫平衡有關。但本研究尚存在一定的不足，未設置通路激活劑組進行驗證，此外，由于條件限制，本研究只在動物水平進行了驗證，下一步可從細胞水平上進行探討。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

趙利平：設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫；梁衛章：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；張俊民、代寶春：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；姜紅、劉秀珍：進行統計學分析