原花青素B2對PM2.5急性暴露致大鼠心臟毒性的保護作用

任敬一，沈 強，陳君蘭，陳夢圓，呂帥帥，馬玉霞

(河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北省環(huán)境與人群健康重點實驗室，河北 石家莊 050017)

近年來，大氣污染對居民健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展造成了巨大影響，尤以PM2.5對人體的損傷較為嚴重[1]，PM2.5是構(gòu)成可吸入顆粒物的主要成分，PM2.5會把有毒有害物質(zhì)帶入肺泡，部分有毒有害物質(zhì)會通過肺泡毛細血管屏障入血，進而損傷身體各個部位[2]。大量流行病學(xué)研究證實PM2.5與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率密切相關(guān)[3-4]，Miller等[5]研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露水平每增加10 μg/m3，心血管事件風險增加24%、心血管疾病死亡風險增加76%。研究表明，營養(yǎng)干預(yù)可以明顯減輕因PM2.5暴露引起的肺部和心血管的炎癥和氧化損傷[6-8]。原花青素是一類多酚化合物，具有抗炎、抗氧化和清除機體產(chǎn)生的自由基等多種作用。原花青素B2(procyanidin B2,PCB2)是原花青素的一種形式，已有研究顯示PCB2可以減輕百草枯引起的肺部炎癥[9]，對黃曲霉毒素引起的肝損傷也具有保護作用[10]，本研究旨在探討PCB2 對大氣PM2.5引起的心臟炎癥和氧化應(yīng)激的保護作用，以期為預(yù)防PM2.5引起的損傷及PCB2的臨床應(yīng)用提供實驗參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 KC-1000型大流量采樣器購自上海隆拓儀器設(shè)備有限公司，KQ-500B型超聲震蕩儀由昆山市超聲儀器有限公司提供，F(xiàn)ree Zone 2.5 Plus型真空冷凍干燥儀為LABCONCO公司產(chǎn)品，Multiskan FC型酶標儀為Thermo Scientific公司產(chǎn)品，TP-114型紫外可見分光光度計為Metash公司產(chǎn)品。PCB2(HPLC≥98%)為南京源植生物科技有限公司產(chǎn)品，白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA )檢測試劑盒為上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號分別為ml037361、ml02828和ml002816，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，貨號分別為A005-1-2、A003-1-2和A001-3-2。

1.2PM2.5的采集及處理 2017年11月-2018年3月使用大氣采樣器在石家莊市長安區(qū)某高校樓頂(高約10 m左右，周圍沒有明顯的工業(yè)污染源)進行采樣，PM2.5會隨氣流富集到采樣濾膜上。小心將采樣后的濾膜裁剪成小塊浸沒于三蒸水中，經(jīng)超聲震蕩，洗脫顆粒。紗布過濾，收集濾液，冷凍真空干燥，-80 ℃保存待用。染毒前，用無菌生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的懸濁液，超聲震蕩混勻。

1.3實驗動物分組及處理 體重150～180 g的SPF級雄性SD大鼠共24只，購買于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號為：SCXK (冀) 2018-004。養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，溫度(21±1)℃，相對濕度40%～60%。采用隨機數(shù)字表法隨機分為3組，每組8只，分別為生理鹽水對照組、PM2.5組和PCB2組。PCB2組給予PCB2灌胃，灌胃劑量為40 mg/kg，以體重計，生理鹽水對照組和PM2.5組給予三蒸水灌胃，均持續(xù)21 d。在第8，10，12天，對PM2.5組和PCB2組大鼠進行氣管滴注細顆粒物懸濁液(滴注劑量為10 mg/kg)，對生理鹽水對照組氣管滴注生理鹽水。最后一次灌胃24 h后，使用10%烏拉坦(10 mg/kg)麻醉，取心臟于-80℃冰箱凍存，備用。

1.4心臟組織病理學(xué)觀察 取大鼠心臟，使用生理鹽水沖洗，取心臟橫切截面組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，將蠟塊固定于切片機上，調(diào)整厚度為6 μm，切片完成后進行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，在顯微鏡下觀察心臟的病理學(xué)改變及炎性細胞的聚集情況。

1.5指標測定 心臟組織稱重，組織勻漿3 000 r/min離心15 min，離心半徑為7 cm，取上清。嚴格按照測試盒說明進行各項指標測定，包括炎性損傷指標(IL-1β、IL-6、IL-18)和氧化應(yīng)激指標(MDA、SOD、GSH-Px)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般體征的變化 實驗過程中未見大鼠死亡，生理鹽水對照組、PM2.5組和PCB2組均正常生長。與生理鹽水對照組相比，氣管滴注PM2.5后，大鼠出現(xiàn)明顯的活動和攝食減少，呼吸出現(xiàn)哮鳴音，精神萎靡，皮毛光澤度下降，對外界刺激反應(yīng)緩慢。

2.2大鼠心肌細胞組織學(xué)變化 低倍鏡下，生理鹽水對照組心肌組織細胞排列整齊，肌纖維走行一致，細胞核清晰可見；PM2.5組心肌細胞排列不整齊，心肌間可見部分毛細血管擴張充血，血管周圍淋巴細胞浸潤；PCB2組與PM2.5組比較，心肌細胞排列較整齊，未見毛細血管充血及明顯炎癥細胞浸潤。在高倍鏡下，對心臟組織心肌纖維排列變化和炎性浸潤的觀察更明顯，PCB2組逆轉(zhuǎn)損傷的趨勢與低倍鏡觀察結(jié)果相近。見圖1。

圖1 大鼠心臟組織HE染色病理學(xué)圖片

2.3PCB2對PM2.5所致大鼠炎癥損傷的保護作用 與生理鹽水對照組相比，PM2.5組的IL-1β、IL-6和IL-18的含量均顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PM2.5組相比，PCB2組IL-1β、IL18均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 PM2.5致大鼠心臟炎性反應(yīng)及原花青素B2的保護作用Table 1 Effects of PCB2 on PM2.5 induced inflammatory response of heart tissues in rats

2.4原花青素B2對PM2.5所致大鼠心臟氧化應(yīng)激的保護作用 與生理鹽水對照組相比，PM2.5組大鼠心臟中SOD和GXH-Px的含量降低，MDA含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PM2.5組相比，PCB2組SOD和GXH-Px含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 PM2.5致大鼠心臟氧化應(yīng)激的影響及PCB2的保護作用 Table 2 Effects of PCB2 on PM2.5 induced oxidative stress of heart tissues in rats

3 討 論

大氣顆粒物是大氣中各種固態(tài)和液態(tài)顆粒狀物質(zhì)的總稱，成分復(fù)雜，直徑越小危害越大，PM2.5作為環(huán)境中空氣動力學(xué)直徑較小的顆粒物會嚴重損傷人體的各個器官。PM2.5不僅會對呼吸系統(tǒng)造成影響[11]，而且也是誘發(fā)心血管疾病的重要因素[12-14]。流行病學(xué)研究表明，長期PM2.5暴露可明顯增加缺血性心臟病、心律失常、心力衰竭和心臟驟停患者的死亡風險[3,15]，對心臟有毒性作用。有研究顯示，PM2.5暴露引起的心血管疾病是由內(nèi)皮細胞損傷和全身炎癥介導(dǎo)所致[16-17]。當機體受到PM2.5攜帶的有害物質(zhì)刺激后，自身發(fā)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激會使血管平滑肌細胞生長和遷移，血管壁增厚，促進內(nèi)皮細胞凋亡，損傷血管。血管內(nèi)皮損傷會導(dǎo)致血管舒縮功能障礙，造成心肌缺血等心臟病變。同樣血管損傷也可致脂質(zhì)沉著和血栓形成，引起冠狀動脈粥樣硬化等病癥，嚴重可造成心力衰竭危及生命。

原花青素是植物中廣泛存在的一類多酚化合物的總稱，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多種藥理作用。研究表明原花青素可以下調(diào)促炎因子水平，降低促炎介質(zhì)的活性，通過抑制MAPK信號通路抑制炎性損傷[18]。Rong等[19]研究顯示原花青素可以減少一氧化氮的產(chǎn)生和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達，對內(nèi)皮有保護作用，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶依賴的機制降低氧化應(yīng)激，對動脈粥樣硬化具有一定的改善作用。PCB2是原花青素中功能活性最強的部分，然而目前為止，關(guān)于PCB2在PM2.5所致心臟損傷中的保護作用未見報道。

PM2.5可導(dǎo)致心臟損傷，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)被認為是其發(fā)生的中心機制。本研究結(jié)果顯示，PM2.5急性暴露后，心肌組織發(fā)生了炎性改變，心肌中毛細血管擴張充血，淋巴細胞浸潤；對炎癥因子檢測發(fā)現(xiàn)，PM2.5誘導(dǎo)了IL-1β、IL-6和IL-18的升高，說明PM2.5介導(dǎo)了心臟的炎性反應(yīng)，而PCB2可以降低心肌中因PM2.5暴露導(dǎo)致的IL-1β和IL-18的表達。提示PCB2可以改善心臟的炎性反應(yīng)，對PM2.5暴露所致的心臟損害有一定保護作用。研究表明，PM2.5暴露還可以導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化損傷，機體在遭受氧化損傷時，抗氧化酶發(fā)揮著重要的作用。SOD可以抑制活性氧的生成，GSH-Px可以有效將機體中產(chǎn)生的有害過氧化物還原為無害的羥基化合物，從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物的干擾和損害。本研究的氧化損傷指標顯示，PM2.5暴露導(dǎo)致SOD、GSH-Px顯著下降，MDA顯著升高，PCB2干預(yù)可增加SOD、GSH-Px的表達，減少MDA的含量。以上結(jié)果均提示，PM2.5誘發(fā)了心肌細胞的氧化損傷，而PCB2干預(yù)明顯降低了這種影響，提示PCB2可以調(diào)節(jié)機體氧化和抗氧化之間的平衡，改善PM2.5暴露導(dǎo)致的心肌氧化損傷，從而對心肌損害起到保護作用。

如何預(yù)防PM2.5對人體健康的損害一直是公共衛(wèi)生工作者重要的研究課題。原花青素是植物化學(xué)物的一種，在植物中分布廣泛，以葡萄籽中含量最高，我國產(chǎn)量豐富。低聚原花青素作為天然的抗氧化劑在國際上被廣泛使用。本研究從植物化學(xué)物的角度出發(fā)，探討其對大氣污染所致心臟損害的保護作用和機制，為從膳食預(yù)防慢性疾病的發(fā)生提供了思路。但本研究中，對原花青素發(fā)揮作用的機制研究還不夠深入，且對PCB2的起效劑量也沒有涉及，人群研究的數(shù)據(jù)還很缺乏，因此，針對原花青素對心臟損傷的保護作用尚需要進一步研究。