循環微RNA生物標志物應用于子宮內膜異位癥診斷的現狀和挑戰

范琳媛，劉朝暉，盧丹

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院婦科，北京 100026)

子宮內膜異位癥是指子宮內膜組織在宮腔以外的部位定植和生長，多發生于盆腔直腸子宮陷凹及卵巢表面，好發于25～35歲的育齡人群[1]。異位的內膜組織及其引起的炎癥可導致嚴重痛經、性交痛、卵巢腫塊和不孕，影響患者的生活[2]，全球10%～15%的育齡期女性飽受子宮內膜異位癥的困擾[3]。目前臨床診斷子宮內膜異位癥的主要方法為腹腔鏡手術及病理檢查，在因慢性盆腔痛或痛經而行腹腔鏡檢查的患者中，子宮內膜異位癥發病率為30%～50%，且發現時多數已處于中晚期，錯失早期最佳治療時機[4]。因此，尋找特異且敏感的非侵入性診斷方法成為臨床關注的重點。微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類大小為18～25 nt的單鏈小RNA，參與人體約30%的基因調控[5]。miRNA不易被RNA酶降解，可在人體循環血液、唾液、精液和尿液等體液中穩定存在，可作為診斷疾病的標志物[6]。現就循環血液中miRNA的表達與子宮內膜異位癥的關系及其用于子宮內膜異位癥診斷的問題進行綜述，旨在為建立便捷、特異的子宮內膜異位癥診斷方法提供參考。

1 循環血液miRNA特點及在疾病診斷中的研究

miRNA是一類非編碼單鏈RNA，主要通過抑制信使RNA的翻譯或降解信使RNA調控基因表達，并參與機體絕大部分的病理生理過程，如生物發育、細胞分化、細胞生長、細胞凋亡和免疫應答等[7]。miRNA不僅可以用于疾病的診斷，還可用于疾病的分層和治療[8]。有研究表明，miRNA在人體循環血液、唾液、精液和尿液等體液中穩定存在，復雜性、組織特異性較低，且沒有翻譯后修飾，可能作為生物標志物[9]。

隨著對miRNA研究的深入，基于miRNA生物標志物的基因診斷和治療已逐漸應用于臨床[10]。如miR-146a和miR-223可作為敗血癥的生物標志物[11]。鎖核酸技術修飾的miR-155抑制劑已用于T細胞淋巴瘤和真菌病的治療[12]。miR-122是丙型肝炎病毒復制的重要宿主因子，已作為檢測丙型肝炎病毒的生物標志物之一，且miR-122拮抗劑RG-101在抗丙型肝炎病毒方面表現出良好的治療效果[13]。由于miRNA是一個非常短的核苷酸序列，其鳥嘌呤和胞嘧啶水平變化較大，可導致不同的雜交特性，因此對其檢測技術也有較高的要求。

2 循環miRNAs生物標志物與子宮內膜異位癥診斷

子宮內膜異位癥雖然惡變率較低，但其具有腫瘤細胞的增生、擴散和轉移的癌樣特征，也被稱為婦科的“良性腫瘤”[14]。目前，腹腔鏡是診斷子宮內膜異位癥的金標準，但并非所有患者均能及時行手術探查，故子宮內膜異位癥患者的確診和治療通常會被延誤。來自國際10個國家16個研究中心的研究顯示，子宮內膜異位癥的確診平均延遲6.7年[15]，而我國針對400例子宮內膜異位癥患者的研究顯示，其確診平均延遲13.0年[16]。非侵入性檢查的缺乏是造成子宮內膜異位癥確診延遲的重要因素，及時并準確診斷成為子宮內膜異位癥治療的關鍵。隨著miRNA在子宮內膜異位癥發生中的重要作用被發現，許多與子宮內膜異位癥相關的循環血液miRNA標志物被逐漸報道。

2.1miR-17-5p和miR-20a 多項研究顯示，miR-17-5p和miR-20a在子宮內膜異位癥患者血液和組織中表達水平均下調[17-20]。miR-17-5p、miR-20a、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-91a共同組成miR-17-92簇，在子宮內膜異位癥中發揮重要調節作用[17-19]。有研究收集了23例Ⅲ～Ⅳ級子宮內膜異位癥患者和23例正常女性的血液樣本，經芯片分析兩組受試者血清中27種miRNA的表達水平，結果發現其差異有統計學意義，經過多重方法驗證后，miR-17-5p、miR-20a和miR-22的表達明顯下調，與檢測準確性相關的受試者工作特征曲線下面積分別為0.74、0.79 和0.85[19]。另有研究比較80例Ⅰ～Ⅳ期子宮內膜異位癥患者和60例非子宮內膜異位癥患者血清miR-17的表達水平，結果顯示子宮內膜異位癥患者血清miR-17水平明顯下調(受試者工作特征曲線下面積為0.84)[20]。提示通過檢測循環血液中miR-17-5p和miR-20a的表達水平可提高子宮內膜異位癥診斷的準確性。

子宮內膜病變的發生與細胞缺氧密切相關，研究證實，缺氧誘導因子-1α和血管內皮生長因子均是miR-17-5p/20a的下游靶點，miR-17-5p/20a表達水平降低可減弱缺氧誘導因子-1α的轉錄后抑制作用，進而調節缺氧脅迫下細胞中其他蛋白的生成[21]。此外，缺氧誘導因子-1α可刺激環加氧酶2的表達和前列腺素的產生，從而促進局部炎癥的發生[21-22]。而血管內皮生長因子可促進子宮內膜異位癥患者斑塊中的異常血管生成[23]。另有研究表明，miR-20a可作用于抗凋亡蛋白G1/S-特異性周期蛋白D1和核因子E2F3，從而參與異位子宮內膜細胞的增殖并減少其凋亡[24]。以上研究均提示，miR-17-5p和miR-20a可能成為子宮內膜異位癥診斷的潛在生物標志物。

2.2miR-200家族 miR-200家族中的miR-200a、miR-200b和miR-141均與子宮內膜異位癥的發病有關。研究顯示，與非子宮內膜異位癥對照者相比，3種miRNA在Ⅰ～Ⅱ期子宮內膜異位癥患者中表達水平下降，僅miR-200a在Ⅲ～Ⅳ期子宮內膜異位癥患者中表達明顯減少，且miR-200a和miR-200b聯合診斷的靈敏度更高，可達90.6%[25]。另有研究比較了子宮內膜異位癥患者的原位子宮內膜和異位子宮內膜，發現與原位子宮內膜相比，miR-200a、miR-200b和miR-141在異位子宮內膜中表達均下調[26]。

上皮-間充質轉化是子宮內膜異位癥發生的基本過程之一，在此過程中上皮細胞轉化為間充質細胞表型后突破基膜到達子宮腔外[27]。上皮-間充質轉化的主要特征是參與細胞間黏附的相關蛋白缺失，如上皮鈣黏素。研究證實，與同位子宮內膜相比，腹膜子宮內膜異位癥細胞中的上皮鈣黏素表達下調或呈現啟動子區高度甲基化特征[28-29]。鋅指E盒結合蛋白1、鋅指E盒結合蛋白2和Smad交互蛋白1是上皮鈣黏素的轉錄抑制因子，而miR-200b的下調可通過上調鋅指E盒結合蛋白1和鋅指E盒結合蛋白2誘導上皮-間充質轉化，促進子宮內膜的轉移和子宮內膜異位癥的惡性轉化[30-31]。

2.3miR-125b miR-125b在子宮內膜異位癥患者血液中表達上調，有研究將重度子宮內膜異位癥患者與正常女性的血清miRNA表達譜進行了比較，結果顯示重癥子宮內膜異位癥患者的miRNA表達譜中有32個miRNA的表達發生明顯變化，其中miR-125b表達上調約12倍[32]。這些miRNA的靶基因主要富集于凋亡、上皮-間充質轉化、血管生成、細胞遷移黏附、表皮生長因子受體信號通路等生物學過程。同時，有研究比較了Ⅲ/Ⅳ期子宮內膜異位癥患者和非子宮內膜異位癥患者血液樣本，發現子宮內膜異位癥患者血液中多個miRNA表達變化，其中miR-3613-5p和miR-6755-3p表達明顯下調，miR-125b-5p、miR-150-5p、miR-342-3p、miR-143-3p、miR-145-5p、miR-451a和miR-18a-5p表達水平較非子宮內膜異位癥患者升高10倍以上，且miR-125b-5p與子宮內膜異位癥的相關性最顯著[33]。在進一步擴大樣本的研究中，同樣檢測到miR-125b-5p、miR-342-3p和miR-451a表達明顯上調，通過構建miR-125b-5p、miR-451a和miR-3613-5p組合算法根據手術結果預測子宮內膜異位癥存在與否，結果表明所有miRNA均能用于子宮內膜異位癥患者和正常人群的區分診斷，但由于Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期子宮內膜異位癥患者血清miRNA表達比較差異無統計學意義，因此不適用于疾病的進展預測和疾病分期診斷[34]。以上結果顯示，采用miR-125b、miR-451a和miR-3613組合檢測可作為子宮內膜異位癥患者的快速診斷方法，且具有更高的準確性和特異性。

多項研究報道了miR-125b-5p與子宮內膜異位癥的相關性[35-36]。研究顯示，與正常女性相比，子宮內膜異位癥患者的原位內膜和異位內膜中腫瘤蛋白p53的表達水平均降低[37-38]。腫瘤蛋白p53是與人類腫瘤密切相關的蛋白，與細胞周期的調控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡和衰老等生物學功能密切相關。子宮內膜異位癥患者中腫瘤蛋白p53表達減少，可能導致子宮內膜上皮細胞轉移和遷徙功能增強，即具備癌樣特征[38]。研究顯示，腫瘤蛋白p53與miR-125b表達呈負相關，提示miR-125b可能通過與腫瘤蛋白p53相互作用，參與子宮內膜異位癥的發生發展[39]。以上研究均證明，miR-125b可在子宮內膜異位癥的癌樣特征中發揮作用。

2.4miR-122和miR-199a 研究證實，子宮內膜異位癥患者血液中的miR-122和miR-199a表達水平明顯升高，而miR-145、miR-141、miR-542-3p和miR-9表達水平降低；擴大研究顯示，miR-199a、miR-122、miR-145、miR-542-3p與子宮內膜異位癥的相關性較高；進一步研究顯示，miR-199a和miR-122的相對表達還可以區分子宮內膜異位癥的輕重程度，用于區分子宮內膜異位癥分期，且miR-199a和miR-122還與盆腔粘連和病變分布相關，miR-199a和miR-122可能參與激素介導的信號通路，從而發揮調控子宮內膜異位病變的作用[40]。

Maged等[41]的研究納入45例盆腔子宮內膜異位癥患者和35例因盆腔疼痛行腹腔鏡檢查但未診斷為子宮內膜異位癥的患者，結果顯示，子宮內膜異位癥患者血清和腹腔積液中白細胞介素-6、miR-122和miR-199a表達水平明顯高于對照者，且三者呈正相關；血清miR-122和miR-199a檢測子宮內膜異位癥的靈敏度分別為95.6%和100.0%，特異度分別為91.4%和100%。有研究表明，miR-199a可能通過靶向IκB激酶β調控子宮內膜基質細胞的侵襲性，并通過缺氧誘導因子-1α/血管內皮生長因子途徑調控子宮內膜基質細胞在缺氧狀態下的血管生成潛能[42]。以上研究證明，子宮內膜異位癥患者血清miR-122和miR-199a可能是快速診斷子宮內膜異位癥的主要分子之一。

目前，多個研究均報道了可能用于子宮內膜異位癥診斷的循環血液生物標志物miRNA，見表1。總結各研究結果，子宮內膜異位癥患者血液中miR-125b-5p、miR-17、miR-200家族、miR-122和miR-199a可能作為子宮內膜異位癥相關生物標志物候選，但由于各研究臨床樣本選取及實驗方法有所差異，還未得出公認的診斷子宮內膜異位癥的相關生物標志物。有研究提示，若將多個miRNA組合，其敏感性和特異性可能更高[43-45]，見表1。

3 循環血液miRNA生物標志物應用于子宮內膜異位癥的挑戰

目前，雖然子宮內膜異位癥相關miRNA研究已取得一定進展，但將循環血液中miRNA應用于子宮內膜異位癥的診斷還面臨很多挑戰。

3.1非一致性結果 造成研究結果不一致的原因較多，除結果分析時人為因素的干擾，更多由于研究設計的不一致性，如對照組選擇的差異性、標本病理階段的差異性和內參選擇的差異性。既往的子宮內膜異位癥研究中，關于對照的選擇不同，部分研究選取腹腔鏡診斷排除的子宮內膜異位癥患者，部分研究選擇宮頸上皮內瘤變患者，也有研究選取健康者作為對照。已有研究者認識到不同子宮病理/盆腔病理之間的分子相似性有重疊，在關于子宮內膜異位癥的生物標志物的研究中，有必要統一定義對照組[46]。

子宮內膜異位癥的發生是一個多階段逐步演變的過程，研究顯示不同病理階段的子宮內膜異位癥患者血液中miRNA表達水平可能不同，女性月經周期對miRNA水平也會有一定影響[47]。此外，miRNA的研究最常用的內參為U6小核RNA，但有研究提示子宮內膜異位癥患者體內U6小核RNA表達發生明顯變化，實時熒光定量聚合酶鏈反應實驗中內參的選擇也不同，β-肌動蛋白、miR-132、miR-16、miR-30e、miR-99a和miR-103-3p均被作為內參[48]。因此，迫切需要尋找穩定的內參以平衡各研究結果之間的差異。研究提示，非編碼RNA內參基因RNU48、U75和RNU44在惡性子宮內膜組織內表達較U6小核RNA更穩定[48]。

表1 子宮內膜異位癥相關循環miRNA標志物

3.2研究類型單一 既往關于子宮內膜異位癥miRNA生物標志物的研究多集中于實驗層面，這些研究結果也增加了研究者對子宮內膜異位癥發生、發展等機制的認識，但尚需進行更大規模的前瞻性研究以評估血清miRNA水平與子宮內膜異位癥之間的關系及其對子宮內膜異位癥分期診斷的準確性。研究顯示，尋找子宮內膜異位癥早期診斷的特異性miRNA，需要在高度標準化的樣品收集基礎上進行大規模分類分組的深入研究，并通過綜合研究結果建立miRNA診斷模型，對來自多個子宮內膜異位癥中心的患者進行大規模的試驗驗證，有助于推動子宮內膜異位癥領域miRNA診斷的實現[49]。

4 結 語

通過分子方法檢測疾病相關基因或生物標志物，從而輔助臨床醫師快速進行疾病分型、確定治療方案和分析預后，此種模式已成為臨床發展趨勢。目前已有研究報道了循環血液中miRNA在子宮內膜異位診斷中的應用，但尚無統一結果[50]。這要求研究者重視上述問題，不斷完善并深入基礎研究，加強與臨床研究的合作。近期有多篇文獻報道多個miRNA組合在子宮內膜異位癥診斷中的應用，而既往關于miRNA的大量研究也能增加對子宮內膜異位癥發病機制的了解，利于尋找更多的miRNA生物標志物組合，促進循環血液中miRNA檢測早日應用于子宮內膜異位癥的臨床診斷。