豬糞快速降解微生物的篩選

徐登峰 張邑帆 楊柳 朱買勛

(重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

生豬養殖是我國畜禽養殖的重要組成部分，由于省區養殖區域分布廣泛，豬糞的產量較大，傳統的處理方式主要是通過豬糞堆肥進行發酵，處理的時間較長，資源化利用低，豬糞的生產速度遠遠大于處理的速度。同時豬糞中含有大量的營養物質，如果不能夠被及時利用和快速降解，就會污染環境、產生臭氣，造成嚴重的環境污染，也嚴重限制了養殖業的健康可持續發展[1-3]。豬糞的處理有多種方式，其中生物降解因操作簡單、無二次污染、所需設備要求低而倍受關注。由于生物降解的主體是微生物，如何篩選到高效降解糞便的微生物成為本研究的關鍵[4]。盡管，在自然環境中的微生物，絕大多數是非培養的，可培養的只有少部分。但可培養微生物對促進糞便的快速腐熟和穩定、促進環境改善起到十分重要的作用。培養基對微生物的篩選、分離起到十分關鍵的作用，合適的培養基可以加快微生物的篩選進程。本研究根據豬糞中營養物質的特點，設計了細菌耐高溫和降解能力試驗，進行微生物的篩選分離。分離純化得到豬糞快速降解微生物，為后續的研究工作奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 糞污來源

糞污采集于重慶市畜牧科學院種豬場，采集糞污處于堆肥10d、15d、20d，分別采集糞堆4個角落的高、中、低3個層面的樣品，每個糞堆采集的糞樣充分混勻為1個樣品，共采集樣品16個。

1.1.2 主要試劑

水解蛋白質培養基(明膠培養基)，水解脂肪培養基，水解淀粉培養基，纖維素剛果紅培養基，營養肉湯培養基，營養瓊脂培養基，均購于青島高科技工業園海博生物技術有限公司；福爾馬林，剛果紅染料，盧哥氏碘液等試劑均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

SWCJ1D2D超凈工作臺購于蘇州凈化設備有限公司；YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋購于上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HN-25S恒溫培養箱購于青島聚創環保集團有限公司；CX31正置顯微鏡購于奧林巴斯工業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物的分離

準確稱取樣品10g，放入裝有90mL的滅菌生理鹽水，并放有玻璃珠的250mL玻璃杯中，浸泡10min后，置于震蕩器上振動20min。使微生物分散，靜止20～30s，即得到10-1的稀釋度。采用逐步稀釋法：即再用1mL無菌吸管，吸取10-1的稀釋度的溶液2mL移入裝有18mL滅菌生理鹽水的試管中，吹吸3次以上，讓菌液混合均勻，即得到10-2的稀釋度；依次類推，連續稀釋，制得10-3、10-4、10-5、10-6一系列稀釋度菌液。分別接種在營養瓊脂平板上，從平板上選擇生長較好的，具有代表性的單菌落，劃線接種相應的培養基，進行再次純化。同時，微生物制片，用顯微鏡作純度的檢查，如果細菌大小一致，均勻分布，則表明菌種純度好。若菌種不純，應進一步劃線分離，直到獲得純培養物。

1.2.2 耐高溫細菌的篩選

參照文亞雄等[5]的文章，普通細菌可分為中溫型和高溫型，分別將32株純化好的細菌接種于培養基上，置于30℃、37℃、40℃、45℃、50℃培養3d，觀察細菌的生長情況，判定細菌的耐高溫情況。

1.2.3 淀粉降解試驗

參照張鋒等[6]的文章，將能夠耐受高溫的細菌接種在淀粉降解培養基上，分別標記為H1～H12，接種的時候劃“+”，劃線長短為1cm，置于合適的溫度下在培養箱中培養至菌落豐厚，加入盧哥氏碘液，均勻地覆蓋到培養基上，若菌落周圍出現無色透明環圈或者由于碘試劑顏色使培養基輕度發黃者，說明淀粉已經被水解。定量比較篩選細菌水解能力的大小，按以下公式進行計算：

Up=(D/d)2

式中，D為透明環的平均直徑，cm，平均直徑(cm)=(縱向直徑+橫向直徑)/2；d為菌落大小的平均直徑，cm。

1.2.4 明膠液化試驗

參照桂文龍等[7]的文章，將待測細菌菌株劃“+”線接種在平板上，在19℃的溫度下培養至菌落生長豐厚后取出。觀察前將包含菌種的平皿于4℃的條件下放置20～30min。若明膠為固體形態即為不液化，記為“-”;若明膠呈液體狀即為液化，并且肉眼可見記為“+”，其強弱可用“+、++、+++、++++”表示。

1.2.5 纖維素降解試驗

參照張喜慶等[8]的文章，將純化的細菌接種于纖維素降解培養基上，待細菌長滿，加入適量剛果紅使用液，染色1h，棄去染液，加入適量1mol·L-1的NaCl溶液，洗滌30min，測量透明圈和菌落的大小，根據菌落周圍出現透明圈的大小，篩選微生物分解纖維素能力的強弱。按以下公式進行計算，方法與淀粉降解菌能力統計方法相同。

Up=(D/d)2

2 試驗結果

2.1 細菌分離鑒定結果

根據分離得到細菌進行純化后，比較菌落形態、大小、顏色等指標，結合顯微鏡下觀察結果，篩選到32株不同菌落形態的細菌。分別進行了耐高溫培養，發現有30株細菌可以在30℃的溫度下進行生長，而35℃、40℃、45℃、50℃的溫度下細菌的生長株數分別是31株、29株、16株、12株，呈現出明顯的降低趨勢，在糞污堆積的過程中會逐漸升溫，伴隨溫度的升高，也有部分細菌會被高溫殺死，要實現糞污的快速發酵功能，細菌必須能夠持續耐受高溫。

表1 不同溫度培養環境下細菌的生長情況

2.2 細菌對淀粉降解能力測定試驗

由表2可知，有7株細菌出現了明顯的暈環現象，其中H5、H8、H9、H10、H12共5株細菌Up值較高，尤其是H8細菌的Up值達到了7.11，說明水解淀粉的能力較強。

表2 細菌對淀粉降解能力測定結果

2.3 細菌液化明膠能力測定試驗

由表3可知，在12株細菌中，有10株細菌對明膠有液化作用，將生長平板放置到4℃條件下，根據菌落周圍有沒有出現明膠重凝固確定降解菌的強弱，其降解能力為H8>H5≥H10≥H2>H12≥H3≥H9>H6≥H7≥H1，尤其是H8株，液化效果達到++++。

表3 細菌對明膠液化能力測定結果

2.4 細菌對纖維素降解能力測定試驗

由表4可知，經剛果紅篩選平板培養基培養之后，12株細菌均具有降解纖維素的能力，H2、H3、H5、H8、H10降解能力較為明顯，Up值均超過10，尤其是H8的Up值最高，達到了23.52，表現出較好的降解纖維素效果。

表4 細菌對纖維素降解能力測定結果

3 分析討論

在豬糞堆積發酵的過程中，長期的堆積會形成不同的產熱層，高溫層的位置和厚度隨著堆肥發酵時期呈動態變化，其中高溫有助于豬糞的發酵腐熟[9]。由于當前生豬養殖使用了大量的精飼料，導致糞便中有大量的蛋白質和淀粉，因此要高效降解豬糞，首先要降解蛋白質和淀粉。除此之外，養殖中產生的豬糞含有大量的水分，密度較高，糞堆中氧氣含量不足，不能直接堆肥，需要濾干水分，添加大量的木屑、秸稈等纖維素物質，為了實現豬糞的快速發酵，發酵微生物還需要能夠降解纖維素，這樣才能將糞便中的有機物轉化成腐殖質和有機殘渣[10]。試驗中分離的32株細菌中有12株能夠耐受高溫，通過淀粉水解試驗、明膠液化試驗、纖維素降解試驗，兼顧對各成分降解的平衡性，這12株細菌中只有H8株細菌能夠符合要求。說明該細菌具有應用于豬糞堆肥快速腐熟，擴大實際生產應用的潛力。