一株副溶血性弧菌拮抗菌的篩選、鑒定及其抑菌物質特性研究

劉婷,尹啟蒙,周滟晴,趙帥東,季旭,張曉妍,王浩鵬,汪立平,2,3*,樊現遠

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 2(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室,上海,201306) 3(上海海洋大學 食品熱加工工程技術研究中心,上海,201306)4(青島海德誠生物工程有限公司,山東 青島,266000)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,廣泛存在于世界范圍內的河口和海洋環境中,不僅是引起水產養殖(特別是蝦類養殖)中細菌性疾病出現的主要致病菌,還是海產品中引起人類食源性疾病的最常見病原菌[1]。目前防控副溶血性弧菌感染最主要的方式是使用抗生素,但是抗生素在水產養殖和農業中的濫用已導致許多細菌出現了耐藥性,特別是出現了具有多重抗生素耐藥性的副溶血性弧菌菌株,對人類健康和水產養殖業構成嚴重的威脅[2]。因而尋求抗生素的理想替代品迫在眉睫。

抗菌肽是生物體經誘導而自身合成的一種具有生物抗菌活性的小分子蛋白質,多數具有強堿穩定性、熱穩定性以及殺菌、抗菌等特點,且不易使病原微生物產生耐藥性,可對動物和人類的健康發揮重要作用。其中,細菌抗菌肽還具有生產周期短、成本低、得率高、提取容易等優勢,被認為是傳統抗生素的理想替代品[3]。因此,利用細菌產生的抗菌肽來控制副溶血性弧菌的感染已經成為一個重要的發展趨勢和研究方向[4]。當前可產生抗菌肽的細菌中研究較多的是乳酸菌和芽胞桿菌,但乳酸菌所產抗菌肽的抑菌譜較窄,而芽胞桿菌本身具有抗逆性,對環境的適應力更強,且其所產抗菌肽的種類多,抑菌譜廣,因此具有更大的開發和應用價值[5]。目前已有將枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)所產抗菌肽應用于防治副溶血性弧菌感染的研究,如PU等[6]表明枯草芽胞桿菌產生的抗菌肽不僅可以抑制副溶血性弧菌,還可以改善蝦類的生長。另外,CHENG等[7]從枯草芽胞桿菌E20發酵豆粕中提取出了抗菌肽FSB-AMP,其可抑制蝦類養殖中的弧菌感染。然而,目前來自海洋環境中的產抗菌肽的枯草芽胞桿菌的報道較少,部分枯草芽胞桿菌所產抗菌肽對副溶血性弧菌的抑制作用不夠強,抑菌特性的研究也不夠深入。

本文從蘆潮港的海泥中篩選出1株產廣譜抗菌肽的枯草芽胞桿菌,其對副溶血性弧菌、腐生葡萄球菌和大腸桿菌等致病菌有較強的抑制作用,并對其生物學性質和抑菌譜進行了研究,為該抗菌肽的深入研究和應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

海泥：上海市浦東新區臨港新城蘆潮港附近海域的海灘。

1.1.2 指示菌及培養條件

供試指示菌的種類和來源見表1,細菌于37 ℃、150 r/min培養12 h,酵母菌于30 ℃,150 r/min培養16 h。

表1 指示菌種類及來源Table 1 Origins and classification of indicator strains

1.1.3 培養基

目標菌株分離純化與形態觀察所用培養基：LB培養基。

目標菌株初篩培養基：Landy液體培養基[8](葡萄糖20.0 g/L,L-谷氨酸5.0 g/L,酵母提取物1.0 g/L,L-苯丙氨酸 2.0 mg/L,KCl 0.5 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.15 g/L,MnSO45.0 mg/L,CuSO4·5H2O 0.16 mg/L,pH 7.0)。

目標菌株復篩所用種子培養基和發酵培養基：Landy液體培養基[8]。

指示菌培養基：單核細胞增生李斯特菌采用胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(tryptic soy broth-yeast extract,TSB-YE)培養基培養,其他細菌采用LB培養基培養,真菌采用YPD培養基培養,劃線純化時固體培養基中瓊脂含量為1.8%(質量分數),進行抑菌試驗時培養基中瓊脂含量為1.0%(質量分數)[9]。

1.1.4 試劑及儀器

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-GGTTACCTTGTTAGG ACTT-3′)、木瓜蛋白酶,生工生物工程(上海)股份有限公司；堿性蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司；其他化學試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

LDZX-30FA型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺,上海博迅實業有限公司；隔水式恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司；PHS-25型pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司；ZQWY-218V型臥式大容量全文振蕩培養箱、ZHSY-50S型水浴恒溫振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司；H2050R型高速冷凍離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀,北京六一儀器廠；A300型PCR儀,杭州朗基科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海泥樣品中菌株的分離

稱取10 g海泥樣品于盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,均質后90 ℃恒溫水浴10 min以殺死大部分的非芽胞桿菌,再接著用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋至10-5。分別吸取稀釋度為10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液100 μL均勻涂布于LB固體培養基上,置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。選取稀釋倍數合適的平板,挑取具有芽胞桿菌典型形態的菌落進行劃線純化,純化3次后編號并用甘油保藏。

1.2.2 抗副溶血性弧菌菌株的初篩與復篩

初篩：采用瓊脂擴散法進行菌株初篩[10]。將上述純化后的菌種接種至Landy液體培養基中,37 ℃、150 r/min培養12 h后,將發酵液置于4 ℃冰箱中備用。將副溶血性弧菌(V.parahaemolyticusATCC 17802)接種至LB液體培養基中,37 ℃、150 r/min培養12 h后,制備成菌濃度為107CFU/mL的指示菌懸液。將15 mL LB培養基(含質量分數為1.0%的瓊脂)與50 μL指示菌懸液混合均勻后,倒入直徑為90 mm的無菌平板內。待其完全凝固后打孔(直徑為7 mm),每孔加入發酵液50 μL,置于37 ℃培養12 h。觀察孔周圍是否形成抑菌圈。試驗重復3次,選擇具有抑菌活性的菌株進行下一步復篩。

復篩：將初篩得到的活性菌株于LB固體培養基上劃線活化3次后,將單菌落接種到Landy種子培養基中,37 ℃、150 r/min培養24 h后,再以5%(體積分數)的接種量接種到Landy發酵培養基中,37 ℃、150 r/min培養24 h。然后將發酵液于4 ℃、10 000 r/min離心15 min,上清液經過0.22 μm的無菌濾膜過濾得到無細胞上清液,置于4 ℃冰箱中備用[9]。以副溶血性弧菌(V.parahaemolyticusATCC 17802)、蠟樣芽胞桿菌(BacilluscereusAS-1)、大腸桿菌(EscherichiacoliBL21)和炭疽桿菌(BacillusanthraciDS-1)為指示菌,采用瓊脂擴散法進行復篩,按照上述初篩的方法制備各指示菌平板,每孔加入50 μL無細胞上清液,37 ℃培養12 h后,測定抑菌圈的直徑,試驗重復3次。

1.2.3 活性菌株H5的鑒定

形態學鑒定：先采用平板劃線法對活性菌株H5進行3次純化,得到單菌落后根據菌落的形態特征進行初步判斷,再采用革蘭氏染色法對其進行染色,在光學顯微鏡下進一步觀察其染色情況和形態。

分子生物學鑒定：使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒對活性菌株H5的DNA進行提取,以提取出的H5基因組DNA為模板,27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物,進行PCR擴增[11]和瓊脂糖凝膠電泳,然后將PCR擴增產物送到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。然后將測序所得的16S rDNA序列在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中利用BLAST功能進行同源性比對,并使用MEGA5.0軟件構建系統發育樹,最后將該菌株的16S rDNA序列提交至GenBank數據庫中。

1.2.4 活性菌株H5所產抑菌物質的抑菌譜測定

選用包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌在內的22株菌株作為檢測的指示菌,按照1.2.2中的方法測定活性菌株H5的無細胞發酵上清液對這些指示菌的抑制作用,每孔50 μL,37 ℃培養12 h后,測量抑菌圈的直徑,試驗重復3次。

1.2.5 活性菌株H5所產抑菌物質的理化性質

1.2.5.1 熱穩定性

分別取等量無細胞發酵上清液于離心管中,置于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、121 ℃條件下各處理10和30 min,然后立即用冰水浴冷卻至室溫,以未經處理的無細胞發酵上清液為對照,以副溶血性弧菌ATCC 17802為指示菌,采用1.2.2中的方法測定抑菌圈直徑,并按照JAMALUDDIN等[12]的方法計算抑菌活性,試驗重復3次。

1.2.5.2 酸堿穩定性

分別取等量無細胞發酵上清液于離心管中,用5 mol/L的HCl溶液和5 mol/L的NaOH溶液調節樣品的pH,使其pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0,以加無菌水至相同體積的無細胞上清液為對照,37 ℃水浴1 h后[13],再調節pH值至7.0,并用無菌水定容至相同體積,抑菌活性的測定和計算方法同上,試驗重復3次。

1.2.5.3 紫外線穩定性

分別取等量無細胞發酵上清液于離心管中,置于距30 W紫外燈90 cm處照射10、20、30、40、50、60 min后[9],以未經處理的無細胞發酵上清液為對照,抑菌活性的測定方法和計算方法同1.2.5.1,試驗重復3次。

1.2.5.4 金屬離子穩定性測定

配制濃度均為100 mmol/L的NaCl、KCl、MnCl2、MgCl2、CaCl2、ZnCl2和AlCl3溶液,滅菌后備用。分別取等量無細胞發酵上清液于離心管中,并分別加入上述溶液使得體系中Na+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Al3+的終濃度為10 mmol/L[14],以加入相同體積無菌水的無細胞上清液為對照,室溫靜置2 h。抑菌活性的測定方法和計算方法同1.2.5.1試驗重復3次。

1.2.5.5 有機溶劑穩定性測定

取等量無細胞發酵上清液于離心管中,分別與等體積的丙酮、甲醇、乙醇、乙腈混合,對照組加入等體積的無菌水,室溫下作用2 h[15],抑菌活性的測定方法和計算方法同1.2.5.1試驗重復3次。

1.2.5.6 蛋白酶敏感性

將胃蛋白酶用25 mmol/L HCl-KCl(pH 2.0)配制成4 mg/mL的母液,中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)也分別配制成4 mg/mL的母液,分別加入到等量的無細胞發酵上清液中,使得樣品中各酶的最終質量濃度均為1 mg/mL,調節pH值至各酶作用的最適pH值,以加入相同體積無菌水的無細胞上清液為對照,37 ℃條件下水浴2 h后,再將pH值調節至7.0[16],用無菌水定容至相同體積。抑菌活性的測定方法和計算方法同1.2.5.1,試驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 抗副溶血性弧菌菌株的篩選

本試驗從上海市蘆潮港海泥樣品中共分離得到90株具有明顯芽胞桿菌形態的菌株,依次編號為H1～H90。經過初篩共得到15株對副溶血性弧菌有抑菌活性的菌株,進一步復篩后得到6株可產生抑菌物質的活性菌株,分別為菌株H1、H5、H17、H18、H20和H26,其對4種致病菌的抑菌效果如表2所示。菌株H17僅對副溶血性弧菌有抑制作用,菌株H1、H18和H26都僅對4種致病菌中的其中3種有抑制作用,而菌株H5和H20對4種致病菌均有抑制作用,且菌株H5的抑菌活性更顯著,因此選擇菌株H5進行后續的試驗。

表2 具有抑菌活性的菌株對4種致病菌的抑制作用Table 2 Inhibition effect of antimicrobial bacteria against four pathogenic bacteria

2.2 活性菌株H5的鑒定

2.2.1 活性菌株H5的形態學觀察

如圖1-a所示,活性菌株H5在LB固體培養基平板上培養12 h后,菌落為微黃色、圓形、隆起,邊緣整齊,不透明,表面粗糙；如圖1-b所示,菌株H5經革蘭氏染色后于光學顯微鏡下觀察,菌體呈紫色,證明該菌株為革蘭氏陽性菌,菌體呈桿狀,可初步判斷菌株H5屬于芽胞桿菌屬。

a-LB固體培養基上的菌落形態； b-革蘭氏染色形態(1 000×)圖1 菌株H5的形態學特征Fig.1 Morphological features of strain H5

2.2.2 活性菌株H5的分子鑒定

以27F和1492R為引物,菌株H5的基因組DNA為模板進行PCR擴增。用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測,在1 000～2 000 bp處形成1條清晰的擴增條帶,將PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果顯示,菌株H5的16S rDNA序列大小為1 101 bp,采用MEGA 5.0軟件以芽胞桿菌屬下的8個種的模式菌株的16S rDNA序列構建系統發育樹,進行1 000次bootstrap測試分析,結果如圖2所示。

其中相似性最高的是B.subtilisstrain NBRC 13719T(NR 112629.1),相似性為98.72%,其次是Bacillusvallismortisstrain DSM 11031T(NR 024696.1),相似性為98.61%,表明菌株H5在親緣關系上與枯草芽胞桿菌最為相近。因此,結合菌落形態學特征、菌株形態學特征和16S rDNA序列分析,將菌株H5鑒定為枯草芽胞桿菌。將菌株H5的測序結果提交到GenBank數據庫中,登陸號為MK880419.1。

圖2 基于16S rDNA基因序列構建的枯草芽胞桿菌H5 系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of B.subtilis H5 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 枯草芽胞桿菌H5的抑菌譜

如表3所示，通過對包括常見的致病菌和酵母菌在內的22株指示菌進行抑菌實驗，發現B.subtilisH5對所有供試的9株革蘭氏陽性菌、除嗜水氣單孢菌以外的8株革蘭氏陰性菌和3株酵母菌均有抑制作用，且對革蘭氏陽性菌抑菌的抑制作用要大于革蘭氏陰性菌。

表3 枯草芽胞桿菌抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of B.subtilis H5

B.subtilisH5對10株革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑在(10.86±0.21)～(32.05±0.10)mm，其中對副溶血性弧菌ATCC17802的抑制作用最強，其次是大腸桿菌和銅綠假單胞菌；其對9株革蘭氏陽性菌的抑菌圈直徑為(13.08±0.12)～(27.92±0.06)mm，其中對金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌和單核細胞增生李斯特菌ATCC19114有強烈的抑制作用。而朱晶婷[17]篩選出的枯草芽胞桿菌D9產生的抗菌肽僅對哈維氏弧菌、創傷弧菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用，且抑菌圈直徑均小于12.0 mm。此外，孫珊[18]篩選出的枯草芽胞桿菌W321所產抗菌肽可抑制沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌等10株致病菌。由此可見，B.subtilisH5所產的抑菌物質具有廣譜的抑菌活性2。

2.4 枯草芽胞桿菌H5所產抑菌物質的理化性質

2.4.1 熱穩定性

由圖3可知,B.subtilisH5產生的抑菌物質在10～70 ℃下處理10 min時,其抑菌活性無顯著變化；在80～100 ℃分別處理10和30 min后,其抑菌活性稍有下降,且在100 ℃條件下處理30 min,其抑菌活性僅下降了21%；在經過高壓蒸汽滅菌(121 ℃,30 min)后,仍保留62%的抑菌活性。有學者研究發現,B.subtilisR75和H19產生的抗菌肽僅在121 ℃處理10 min后,其抑菌活性基本喪失,不能耐受高壓蒸汽滅菌[9,19]。結果表明,B.subtilisH5產生的抑菌物質具有良好的熱穩定性,可以在巴氏殺菌和高壓蒸汽滅菌的條件下保持較高的抑菌活性,為其在食品加工業和醫藥行業中的應用奠定基礎。

圖3 溫度對B.subtilis H5所產抑菌物質的影響Fig.3 Effect of temperature on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

2.4.2 pH穩定性

由圖4可知,B.subtilisH5產生的抑菌物質在中性和中酸性條件下的抑菌活性較高,在堿性條件下的抑菌活性略低于在酸性條件下的抑菌活性,尤其是在pH>9.0時,其抑菌活性明顯下降。白杰等[20]和ANGELIKI[21]等的研究均表明抗菌肽在堿性環境中的活性損失更大,這與本研究的結果一致。另外,當pH值分別為2.0和12.0時,B.subtilisH5所產生的抑菌物質仍保留77%和67%的抑菌活性,說明其在極端酸堿的環境中仍可發揮明顯的抑菌作用,而抗菌肽brevibacillin和brevibacillin V等在強酸強堿條件下基本失活[22]。結果表明,B.subtilisH5產生的抑菌物質有較好的酸堿穩定性,可耐受極端環境,有利于其在食品工業等領域的廣泛應用。

圖4 pH對B.subtilis H5所產抑菌物質的影響Fig.4 Effect of pH on antimicrobial produced by B.subtilis H5

2.4.3 紫外線穩定性

由圖5可知,B.subtilisH5產生的抑菌物質經過紫外線照射處理10～60 min后,其抑菌活性基本無變化,表明其具有良好的紫外線穩定性。因此,可將紫外線殺菌技術和生物防腐劑聯合應用于食品中,大大地提高食品的保鮮防腐效果,從而延長食品的保質期。

圖5 紫外線對B.subtilis H5所產抑菌物質的影響Fig.5 Effect of UV on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

2.4.4 有機溶劑穩定性

由圖6可知,B.subtilisH5產生的抑菌物質分別與甲醇、乙醇、丙酮和乙腈在室溫條件下作用2 h,發現其對4種有機溶劑具有較好的耐受能力,抑菌活性無明顯變化,這為該抑菌物質的提取、分離純化和分析提供了有力的理論依據[23]。

2.4.5 金屬離子穩定性

由圖7可知,供試的各種陽離子對B.subtilisH5所產抑菌物質的活性有不同程度的影響,10 mmol/L的Na+和Al3+對其抑菌活性基本無影響,Ca2+和Mg2+會抑制其約7%的抑菌活性,而Mn2+和Zn2+則可提高其抑菌活性。尚偉[24]的研究結果表明,Bacillusvelezensis產生的抑菌物質同樣會受到Ca2+的抑制,且高濃度的Mn2+會促進其抑菌活性。

圖7 金屬離子對B.subtilis H5所產抑菌物質的影響Fig.7 Effect of metal ions on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

2.4.6 酶穩定性

由圖8可知,經過胃蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶處理后,B.subtilisH5所產抑菌物質的活性均有不同程度的下降,表明該抑菌物質屬于蛋白質類或者肽類物質。其中,經木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶處理后,抑菌物質的活性僅下降了9%～20%,說明其對大多數蛋白酶具有一定的耐受性,這與抗菌肽分子質量小和它可能有環狀結構有關[25]。另外,B.subtilisH5產生的抑菌物質對蛋白酶K和胰蛋白酶最為敏感,尤其是在胰蛋白酶的作用下,其抑菌活性下降了約28%。

圖8 蛋白酶對B.subtilis H5所產抑菌物質的影響Fig.8 Effect of proteases on antimicrobial substance produced by B.subtilis H5

3 結論

枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)是一種內生胞子的革蘭氏陽性菌,在過去的幾十年里,其產生抗菌物質的能力得到了廣泛的認可[26]。本研究從蘆潮港海泥中篩選出1株具有廣譜抑菌性的枯草芽胞桿菌H5,尤其是對副溶血性弧菌、腐生葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌有強烈的抑制作用。經過6種蛋白酶處理后,B.subtilisH5所產抑菌物質的活性均有不同程度的下降,可見其產生的抑菌物質屬于蛋白質類或者肽類物質。通過對B.subtilisH5所產抗菌肽的理化性質進行研究,發現其具有良好的溫度穩定性、紫外線穩定性和有機溶劑穩定性,可耐受高壓蒸汽滅菌；可在較寬的pH范圍內(2.0～11.0)保持活性,有利于其在食品工業等領域的廣泛應用；10 mmol/L的Ca2+和Mg2+會抑制其抑菌活性,而Mn2+和Zn2+則可提高其抑菌活性,為其開發和應用提供了理論基礎。與已報道的枯草芽胞桿菌產生的抗菌肽相比[9,17-18,25],枯草芽胞桿菌H5產生的抗菌肽不僅具有良好的穩定性,且抑菌譜更廣,抑菌活性更強,在食品工業、畜牧業和醫藥行業等領域具有廣闊的應用前景。本實驗室將進一步對枯草芽胞桿菌H5所產抗菌肽的純化、鑒定與抑菌機制等進行深入研究。