獼猴桃Ac-miR160d啟動子區的克隆及表達分析

李哲馨，祝 瀅，蔣 娟，決登偉，李洪雷，唐建民，蘭建彬

（1.重慶文理學院 園林與生命科學學院/特色植物研究院，重慶 402160； 2.重慶市特色植物產業協同創新中心，重慶 402160；3.重慶市經濟植物生物技術重點實驗室，重慶 402160）

獼猴桃Actinidia chinensis是我國山區脫貧攻堅的重要產業，然而其果實在采后貯藏過程中極易遭受各類病原菌侵染而變軟腐爛，成為阻礙獼猴桃產業發展的重要因素[1]。MicroRNA（miRNA）是一類長度為20 ～24 個核苷酸的非編碼RNA，通過與目標基因序列互補實現對靶標的沉默，從而調控生命活動中的一系列重要生物學過程，并被證實參與植物和逆境脅迫的互作[2-4]。研究獼猴桃miRNA 介導的轉錄調控機制，可為利用miRNA 改良獼猴桃品種、提升果實貯藏保鮮品質提供重要的基因資源。

MiR160 作為miRNA 家族的重要一員，通過靶向生長素響應因子ARFs 參與生長素信號傳導途徑并發揮調控作用[5]。多項研究結果證實，miR160 參與植物生物脅迫過程。火炬松莖部感染銹病真菌會導致miR160 的表達受到抑制而下調表達[6]。Perez-Quintero 等的研究結果表明，木薯miR160 通過調節生長素信號傳導參與對細菌性萎蔫病菌的響應，且調節生長素信號傳導可能是抑制植物細菌生長的重要策略[7]。大豆感染煙草花葉病毒后，miR160 被誘導發生明顯上調表達[8]。 MiR160 在易感水稻品種中的過表達導致植株對米曲霉的抗病性增強[9]。以上研究結果表明，miR160 參與對真菌病原菌的防御反應。

目前，miR160 已經在擬南芥、蘋果、楊樹等多種植物中被發現，并被證實參與植物的許多生物學功能[10-13]，但尚不清楚miR160 上游受哪些轉錄因子的調控。啟動子是必需的基因轉錄起始調控區域，對miRNA 核心啟動子和順式作用元件的鑒定與分析有助于了解miRNA 的活化機制及其在整個調控網絡中的重要作用。本研究前期，筆者通過小RNA 測序發現，被灰霉菌Botrytis cinerea侵染后獼猴桃miR160d 被誘導上調表達，推測Ac-miR160d的啟動子很可能是逆境誘導型啟動子。為給Ac-miR160d 在逆境應答中的功能研究提供參考，本研究中克隆Ac-miR160d 的啟動子序列，分析啟動子序列中含有的順式作用元件及轉錄因子結合域，并對Ac-miR160d 表達受逆境誘導調控進行驗證。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以遺傳背景清晰的‘紅陽’獼猴桃Actinidia chinensiscv.‘Hongyang’的果實作為試驗材料。果實采集自重慶文理學院黃瓜山獼猴桃示范基地。因樹體上發育果實的不確定因素較多，如病蟲害入侵、果實位置、氣候條件等，增加了試驗結果的不確定性。為盡量避免上述不確定性因素，采集授粉后130 d 約95 g 的獼猴桃果實，并在采后3 h 內運回實驗室，使用2%次氯酸鈉消毒2 min，再用自來水沖洗2 ～3 次，晾干后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料的脅迫處理

灰霉菌HFXC-16 菌株分離自感染獼猴桃[14]，提前2周接種到新的PDA培養基上，在25 ℃條件下培養備用。用無菌水稀釋菌體，制成104CFU/mL 的菌懸液。將采集的果實隨機分成3 組，每個果實用無菌針管扎5 mm 深，造成傷口并晾干后，分別推入10 μL 無菌水、100 mmol/L NaCl 溶液、灰霉菌懸液和40 mg/kg GA3溶液。雖然采摘后的果實可能會發生一定的基因表達的變化，但在進行脅迫處理時設置了對照組試驗，miR160d 表達水平的規律性變化可以說明其參與獼猴桃植物激素信號及逆境脅迫的響應。每處理3 次重復，每次重復處理10 個果實，置于光照培養箱中暗培養（溫度25 ℃、濕度85%）。侵染0、1、2、3、4、5、6 d 時采集創傷口周圍樣品，使用液氮迅速冷凍并置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 Ac-miR160d 啟動子克隆與RNA 二級結構分析

采用CTAB 法提取獼猴桃基因組DNA。采用TransStart?FastPfuDNA Polymerase 高保真酶（全式金，北京）進行PCR 擴增，反應體系和條件參照說明書。將擴增產物連接至克隆載體pEASY?- Blunt Cloning Kit（全式金，北京）并進行測序驗證。所用引物序列（5′—3′）的上游引物為AAACAAATACGCTTTAAGATGTGA，下游引物為GTTTCATGCACATGCACACA。通過在線工具Mfold（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）分析各前體序列的RNA 二級結構。

1.2.3 Ac-miR160d 啟動子序列的生物信息學分析

使用Neural Network Promoter Prediction 在線軟件（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）進行核心啟動子預測；使用PlantCARE 網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析Ac-miR160d 啟動子區域可能存在的順式作用元件；使用PROMO 在線軟件（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）對Ac-miR160d 啟動子序列的轉錄因子結合位點進行預測，設置物種范圍為植物。

1.2.4 Ac-miR160d 啟動子序列的qRT-PCR 分析

使用RNAiso Plus 試劑盒（Takara，大連）提取總RNA，使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 試劑盒（全式金）合成第一鏈cDNA，使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒（全式金）進行qRT-PCR 分析。所用引物序列（5′—3′）的上游引物為TGCCTGGCTCCCTGTATGAA，下游引物 為GTGCAGGGTCCGAGGT。 以β-actin作 為內參基因[15]，所用引物序列（5′—3′）的上游引物為GCAGTGTTTCCCAGTATTGT，下游引物為TCCATGTCATCCCAGTTGC。

2 結果與分析

2.1 Ac-miR160d 啟動子序列克隆

根據‘ 紅陽’ 獼猴桃基因組數據庫（http://kiwifruitgenome.org/）、前期本課題組miRNA 及轉錄組測序結果（已上傳至NCBI，PRJNA645761），獲取獼猴桃Ac-miR160d 前體序列，該前體序列編號為+1 ～+86 bp，以+1 上游 2 111 bp，+86 下游86 bp 作為Ac-miR160d 的預測啟動子，長度為2 283 bp。以獼猴桃果實基因組為模板，采用高保真酶擴增，可獲得單一條帶，通過測序獲得該啟動子及前體基因序列（圖1）。對Ac-miR160d 前體的RNA 二級結構進行分析，發現其具有典型的小RNA 前體序列結構特征，即具有穩定的莖環折疊的RNA 二級結構以及miR/miR*二聚體結構，且無較大的蛋白編碼序列（圖2）。

圖1 Ac-miR160d 預測啟動子克隆Fig.1 Ac-miR160d predicted promoter clone

圖2 Ac-miR160d 前體RNA 的二級結構Fig.2 Secondary structure of Ac-miR160d precursor RNA

2.2 Ac-miR160d 啟動子核心區域預測

啟動子核心區域是保證RNA 聚合酶Ⅱ轉錄正常起始所必需的DNA 序列，包括轉錄起始位點及轉錄起始位點上游-25 ～-30 bp 處的TATA 盒，其確定轉錄起始位點并產生基礎水平的轉錄。使用Neural Network Promoter Prediction 在線軟件，以預測值0.8 作為判斷的截斷值，該啟動子序列可能存在預測分值分別為1.00、0.91、0.82、0.96、0.84 和0.89 的6 段核心啟動子區域，序列分別位 于40 ～90、891 ～941、921 ～971、1 290 ～ 1 340、1 875 ～1 925 及2 060 ～2 110 bp 處，可能轉錄起始位點分別為C、T、A、A、G、A，分別位于81、932、962、1 331、1 926、2 101 bp 處 （表1）。

表1 Ac-miR160d 啟動子核心區域預測結果?Table 1 The prediction result of the core region in Ac-miR160d promoter

2.3 Ac-miR160d 啟動子順式作用元件預測

使用PlantCARE 和PLACE 網站在線分析AcmiR160d 啟動子區域可能存在的順式作用元件，發現該啟動子區域不僅存在TATA-box、CAATbox 等基本轉錄元件，還存在激素應答元件（赤霉素應答元件P-box、水楊酸響應元件TCAelement、脫落酸應答元件ABRE、茉莉酸響應元件CGTCA-motif 等）、參與逆境脅迫的元件（厭氧響應元件ARE、干旱誘導的MYB 結合位點等）以及大量光應答元件（ATCT-motif、G-box、GAmotif、BOX4、GATA-motif、GT1-motif、LAMPelement、MRE、Sp1、chs-CMA2a 等），如圖3 所示。

圖3 Ac-miR160d 啟動子順式作用元件預測結果Fig.3 Prediction of cis-acting elements in Ac-miR160d promoter sequences

2.4 Ac-miR160d 啟動子轉錄因子結合域預測

使用PROMO 在線軟件對Ac-miR160d 啟動子序列的轉錄因子結合位點進行預測，結果發現該啟動子區存在PF1、PBF、SQUA、MYB2、HSF1、 GAMYB、SPF1、Dof2、PHR1 等26 種轉錄因子結合位點（圖4）。

圖4 Ac-miR160d 啟動子轉錄因子結合域預測結果Fig.4 Prediction of Ac-miR160d promoter transcription factor binding domain

2.5 Ac-miR160d 在脅迫處理條件下的表達分析

根據Ac-miR160d 啟動子區順式作用元件的分析結果，分別對獼猴桃果實進行非生物（NaCl、GA3）和生物（灰霉菌）脅迫處理，并檢測AcmiR160d 的水平。結果顯示，當獼猴桃果實受到鹽脅迫時，在脅迫處理后1 d 時Ac-miR160d 的水平即發生明顯下調，脅迫處理后3 ～6 d 時下調更為顯著。當獼猴桃果實受到GA3處理和灰霉菌侵染時，Ac-miR160d 的水平出現先升高、后降低的趨勢，在侵染處理后1 ～2 d 時急劇升高，隨后逐漸降低（圖5）。說明Ac-miR160d 參與獼猴桃鹽脅迫及其與灰霉菌的互作，且與激素調控密切相關。

圖5 Ac-miR160d 在鹽脅迫、GA3 處理及灰霉菌侵染下的表達Fig.5 Expression analysis of Ac-miR160d under salt stress, GA3 treatment and B.cinerea infection

3 結論與討論

本研究中克隆了獼猴桃Ac-miR160d 的啟動子序列，并分析了其順式作用元件及轉錄因子結合域，結合鹽脅迫、GA3處理及灰霉菌侵染后獼猴桃果實內Ac-miR160d 的表達情況，初步驗證AcmiR160d 的表達受逆境誘導調控。

有研究結果表明，miRNA 啟動子序列中含有TATA-box、CAAT-box、CT repeat 等啟動子特征元件[16]。本研究中克隆到的Ac-miR160d 啟動子序列中含有相關元件，說明Ac-miR160d 啟動子符合RNA 聚合酶Ⅱ指導轉錄的基因啟動子的特征。通過啟動子核心區域預測，初步確認獼猴桃Ac-miR160d 啟動子序列的轉錄起始位點在AcmiR160d 上游180 ～1 000 bp 處。

受逆境誘導的miRNA 啟動子存在逆境應答相關元件[17]。在對Ac-miR160d 啟動子元件進行分析時，發現了一些與激素應答、逆境脅迫、光應答相關的元件。這些元件的存在說明Ac-miR160d極有可能參與對激素信號轉導、逆境脅迫和光反應的調控過程。miRNA 的轉錄由復雜的調控系統調節，外界環境刺激或內源信號可促使不同轉錄因子與轉錄調控元件相結合。miRNA 啟動子上轉錄因子結合部位的確定對研究miRNA 的轉錄調控具有重要意義，可為后續Ac-miR160d 上游互作蛋白篩選及對miR160 抗逆調控網絡的挖掘提供參考。本研究中發現Ac-miR160d 啟動子區存在大量參與調控逆境脅迫轉錄因子的結合位點。PBF和Dof2 屬于Dof 家族C2H2 鋅指因子類，PBF 被證實有助于bZIP 轉錄因子結合DNA[18]。MYB 和WRKY 是植物轉錄因子基因家族的2 個大類，參與調控植物對生物和非生物脅迫的雙重響應[19-22]。本研究結果表明，在Ac-miR160d 啟動子區域有MYB2、GAMYB、MYB305 以及SPF1 結合位點，還有參與高溫脅迫響應的HSF1、磷脅迫相關轉錄因子PHR1 等結合位點，這些結合位點均與脅迫誘導調控相關聯。

本研究中分別用無菌水、NaCl 溶液、GA3溶液及灰霉菌懸浮液對獼猴桃果實處理0 ～6 d 后進行qRT-PCR 分析，結果表明miR160d 的表達在獼猴桃果實受鹽脅迫、GA3誘導和灰霉菌侵染后迅速作出反應，推測Ac-miR160d 參與調控獼猴桃果實對NaCl 脅迫及灰霉菌的防御響應，且與激素調控密切相關。在灰霉菌侵染后1 ～2 d 時AcmiR160d 的表達明顯上調，說明獼猴桃果實通過miR160d 的表達抵抗灰霉菌侵染造成的脅迫；隨著脅迫處理后時長的增加，miR160d 的表達有所下調，但在處理后4 d 時有所回升，隨后再次下調，推測獼猴桃果實逐漸適應脅迫后miR160d 的表達有所回升，但是由于無法長時間適應，使得miR160d 再次下調。灰霉菌侵染獼猴桃果實后，miR160d 的表達水平明顯高于赤霉素處理。這些結果進一步說明Ac-miR160d 啟動子為逆境誘導型啟動子。

由于本研究中生物信息學分析結果具有一定的局限性，應進行分子生物學及功能的驗證。下一步將構建Ac-miR160d 啟動子融合GUS基因植物表達載體，利用獼猴桃遺傳轉化體系[23-24]，在多種脅迫和激素誘導條件下，驗證啟動子相應順式作用元件的功能。