牛MMP9啟動子與轉錄因子NF-κB作用的研究

蘇晨，毛永盡，楊慧琳，曲波，趙鋒，崔英俊

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

0 引 言

乳腺發育是一個動態過程，其形態結構和生理功能會隨機體發育在細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）精細調控下而周期性重塑[1]。乳腺的發育過程包括胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期。乳腺發育開始于胚胎期，青春期完成導管的分化和延伸，妊娠期形成分泌性腺泡，泌乳早期乳腺實質與乳腺上皮細胞持續增殖，最后退化期乳腺退化，細胞凋亡，腺泡導管塌陷，乳腺恢復成簡單導管結構[2-3]。腺體經歷重塑恢復至妊娠前的狀態，完成一個周期，從而影響奶牛泌乳。基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP）是基質上皮界面上主要的細胞外蛋白酶，其中基質金屬蛋白酶9（Matrix Metalloproteinases 9，MMP9）被認為是乳腺周期性重塑的關鍵酶[4]。MMP9（明膠酶-b）是一種IV型膠原酶[4]，可由乳腺上皮細胞，基質成纖維細胞和浸潤的免疫/炎癥細胞表達[5-7]。MMP9在形態發生、傷口愈合[8]、組織修復和重塑、細胞生長、炎癥反應[1,9]、腫瘤細胞的侵襲轉移和血管生成[10-13]等生理過程中發揮重要作用。核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一個轉錄因子家族，可調節生長因子，細胞因子，趨化因子，黏附分子和凋亡抑制劑的表達[14-15]。在受到外界刺激時，NF-κB兩個亞基（P65或P50）活化，從細胞質基質轉位到胞核，并與NF-κB反應基因啟動子區域的κB位點相結合，從而啟動基因轉錄[16]。已有研究表明，在人乳腺癌細胞和結直腸癌細胞中MMP9表達受NF-κB信號通路調控[17-18]。但在牛乳腺上皮細胞中MMP9表達是否也受NF-κB信號通路調控還需確認。本研究旨在確認牛MM P9啟動子與轉錄因子NF-κB的相互作用，為改善奶牛牛奶品質提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗室保存的牛乳腺上皮細胞和Hela細胞；實驗室保存的p RL-TK、pGL3-Basic、p GL3-CMV和P65過表達質粒；胎牛血清，BI；DMEM-F12培養液，Gibco；lipofectamineTM2000，Thermo Scientific；Kpn I和Bgl II限制性內切酶，Takara；T 4連接酶，Takara；Celastrol、RIPA裂解液，索萊寶；Dual-Luciferase Reporter Assay System，Promega；Endo-free Plasmid MiniKit II，Omega；SDS-PAGE配膠試劑盒，碧云天；VE-108B垂直電泳槽，Tanon；VE 186轉移電泳槽，Tanon；EPS300電泳儀，Tanon；Sag Capture，天能；Dual-Luciferase報告基因檢測系統，Promega。

1.2 研究方法

1.2.1 牛MMP9啟動子雙熒光素酶報告載體的構建

從奶牛乳腺組織中提取DNA，在NCBI數據庫中查找牛MMP9基因啟動子序列。使用JASPAR、hTFtarget數據庫預測轉錄因子P65（NF-κB的一個亞基）與MMP9啟動子結合位點。設計引物，如表1所示，進行PCR擴增，獲得4條逐級縮短的啟動子片段。PCR產物通過凝膠電泳回收并純化，與p GL3載體質粒分別使用Kpn I和Bgl II進行雙酶切，連接、轉化并測序。測序成功后的MMP9啟動子雙熒光素酶報告載體經擴大培養，提取質粒備用。

表1 MMP9啟動子區引物序列

1.2.2 P65過表達載體的轉染

將牛乳腺上皮細胞接種至6孔板，待細胞長至70%～80%密度時進行轉染。轉染時分為對照組、過表達陰性對照組（轉染pcDNA3.1（+）空載體）和P65過表達組（轉染P65過表達載體）三組。用lipofectamineTM2000進行轉染，具體操作參照說明書。轉染48 h后收取樣品。

1.2.3 蛋白質免疫印跡分析

轉染48 h后，用RIPA裂解液收取1.2.2中各處理組的細胞總蛋白，具體操作參照說明書。按SDS-PAGE配膠試劑盒說明書配制10%的膠電泳，并用濕轉法將蛋白條帶轉至硝酸纖維素薄膜上，時間為90 min。掃描蛋白條帶，用ImageJ軟件分析灰度值。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測

將Hela細胞接種至24孔板，待細胞長至90%密度時，每孔轉染0.5μg空載體或P65過表達載體，與此同時分別將構建成功的4個MMP9啟動子雙熒光素酶報告載體質粒0.5μg或p GL3-Basic質粒和0.01μg p RL-TK質粒（用50μL Opti-MEM稀釋）共轉染進Hela細胞，使用2.0μL LipofectamineTM2 000試劑（用50μL Opti-MEM稀釋）進行轉染，24 h后測定雙熒光素酶活性。NF-κB抑制實驗是在0.5μg P65過表達質粒，0.5μg啟動子質粒及0.01μg p RL-TK質粒共轉染Hela細胞6 h后，添加NF-κB抑制劑Celastrol作為實驗組，同時設置不添加抑制劑的對照組。各組均在轉染24 h后收集細胞。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光活性，通過計算其比值確定MMP9基因核心啟動子片段。

1.2.5 數據分析

使用SPSS26.0和GraphPad Prism8.0對實驗數據進行t-檢驗和方差分析并作圖。數據以平均數±標準誤表示，每個實驗3次重復。數據標記字母相同為差異不顯著，字母不同為差異顯著。“*”代表P＜0.05，表示差異顯著；“**”代表P＜0.01，表示差異極顯著；P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與討論

2.1 MMP9啟動子雙熒光素酶報告載體的構建

利用PCR技術從牛乳腺DNA中擴增獲得4個不同長度的MMP9啟動子片段，并連接至p GL3-Basic雙熒光素報告載體中，構建4個啟動子雙熒光素酶報告載體，分別命名為MMP9-640、MMP9-420、MMP9-380、MMP9-80。用Kpn I和Bgl II對構建的雙熒光素酶載體質粒進行雙酶切鑒定，凝膠電泳預期位置出現條帶，如圖1所示。說明MMP9-640、MMP9-420、MMP9-380、MMP9-80雙熒光素酶載體構建成功。

圖1 MMP9啟動子雙熒光素酶報告載體雙酶切結果

2.2 P65過表達對MM P9蛋白表達的影響

P65過表達載體轉染牛乳腺上皮細胞48 h后，用Western blotting法檢測p-P65、P65及MMP9蛋白表達。結果表明，P65過表達組的p-P65、P65、MMP9的蛋白表達量顯著高于對照組和過表達陰性對照組（P＜0.05），如圖2所示，說明P65過表達能促進MMP9蛋白表達。

圖2 P65過表達后對牛乳腺上皮細胞p-P65、P65、MMP9表達的影響

2.3 牛MMP9啟動子活性分析

在轉染空載體或P65過表達載體的同時，將MMP9啟動子雙熒光素酶報告載體質粒或p GL3-Basic質粒和p RL-TK質粒共轉染進Hela細胞，24 h后測定雙熒光素酶活性。結果表明P65過表達組比過表達陰性對照組的雙熒光素酶活性顯著提高（P<0.05），且MMP9-640、MMP9-420和MMP9-380這3個啟動子片段的活性與p GL3-Basic陰性對照組相比較均差異極顯著（P<0.01），如圖3所示。通過比較不同長度的啟動子片段的活性值，發現MMP9-420的活性值最高，其次分別是MMP9-380和MMP9-640。且MMP9-420與MMP9-380雙熒光素酶活性之間沒有顯著性差異（P＞0.05），說明-420～-80bp區域是轉錄因子NF-κB結合位點。

圖3 MMP9基因啟動子區不同長度片段的熒光活性

2.4 NF-κB抑制劑對MMP9轉錄活性的影響

在轉染P65過表達載體的同時，將MMP9-420啟動子雙熒光素酶報告載體質粒和p RL-TK質粒共轉染進Hela細胞，轉染6 h后分為兩組，一組添加Celastrol，另一組不添加設為對照，轉染24 h后測定雙熒光素酶活性。結果表明，Celastrol組雙熒光素酶活性值顯著低于對照組(P<0.05)，如圖4所示。

圖4 NF-κB抑制劑對MMP9轉錄活性的調節

3 結 論

NF-κB是一個轉錄因子家族，可與多種基因啟動子區域的κB位點結合促進其轉錄表達[16]。黃等[19]研究發現在奶牛乳腺上皮細胞中NF-κB能促進乳合成和乳腺上皮細胞增殖。已有研究表明在人結腸癌細胞和鼠結腸癌細胞中NF-κB信號通路能正向調控MMP9表達[20-22]。但在牛乳腺上皮細胞中MMP9表達是否受NF-κB信號通路調控未見報道。本研究結果發現在牛乳腺上皮細胞中過表達NF-κB的亞基P65后，可以促進MMP9蛋白表達，表明在牛乳腺上皮細胞中MMP9的表達可受轉錄水平調節。MMP9是MMP家族最復雜的形式之一，可降解ECM[23]，參與乳腺重塑[24]，使乳腺發育逐步積累，提高奶牛乳產量。MMP9還可促進奶牛乳腺上皮細胞增殖[25-26]，抑制山羊乳腺上皮細胞凋亡[27]。為進一步確認轉錄因子NF-κB與MMP9啟動子的具體結合區域，本實驗構建4個不同長度的啟動子雙熒光素酶報告載體，通過雙熒光素酶實驗分析各啟動子片段的轉錄活性，得出MMP9啟動子-420～-80 bp區域是轉錄因子NF-κB結合位點。在添加NF-κB抑制劑Celastrol后，啟動子活性顯著降低，進一步說明轉錄因子NF-κB可直接靶向奶牛MMP9基因啟動子區域并促進MMP9基因表達。這一結論為我國目前奶業發展中面臨的困境提供新的解決方法及思路，具有重要的生產實際意義。