GSK650394對慢性應激抑郁癥模型大鼠行為及海馬神經營養的調節作用

劉 丹，藺曉源，楊 蕙，劉彤彤，劉平安，孟 盼*

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院 1.風濕科； 3.醫學實驗中心，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學 科技創新中心, 湖南 長沙 410208)

據世界衛生組織估計，全球約有3.5億人患有抑郁癥，高達40%的患者對抗抑郁藥物反應不充分[1]。在過去的30年里，臨床上多數抗抑郁藥均通過增加腦內單胺神經遞質起效，有效率僅為60%至65%，緩解率為30%，盡管這些藥物在給藥后數小時內會影響神經遞質系統，但癥狀的改善通常需要治療數周(4至6周)后才顯現[2]。故而，亟待從新的角度和視野研發更為有效的抗抑郁藥物。血清和糖皮質激素調節蛋白激酶1(serum and glucoc orticoid-regulated kinase 1，SGK1)是多種抑郁癥相關信號傳導通路和細胞磷酸化級聯反應的交匯點[3]。多項研究表明，SGK1表達或功能的增加與抑郁癥的致病性應激假說有關，其機制主要包括兩方面，其一SGK1是介導下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)軸失調的關鍵介質，其二SGK1可負調控腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)等神經營養素家族成員，從而抑制神經發生[4]。GSK650394是一個新穎的SGK1抑制劑，研究表明，GSK650394可抵消HPC03A/07人海馬祖細胞中皮質醇誘導的神經再生的減少及Hedgehog信號通路的改變[5]。GSK650394具有良好的抗抑郁功效，然其機制尚不清楚?；诖耍緦嶒灁M通過SGK1抑制劑，初步探明SGK1在抑郁癥大鼠抑郁樣情緒行為中發揮的保護作用及其對神經營養的調節機制，以期為基于SGK1激酶的現代抗抑郁藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠，體質量220～240 g, 35只，購自湖南斯萊科景達動物中心，動物合格證號：43004700015235。

1.1.2 藥物與試劑：GSK650394(Sigma-Aldrich公司)；BDNF一抗(Ambion試劑公司)；羊抗兔IgG二抗(Vector公司產品)；ECL化學發光試劑盒、組織蛋白抽提試劑盒(北京中衫金橋有限公司)；Protein Marker(MBI Fermentas公司產品)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(Merck公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠分為對照組、抑郁模型組、GSK650394組。取GSK650394藥物粉末，溶解于2 μL的DMSO中，采用蒸餾水配成終濃度為2.8 g/L的溶液，現用現配。按照1 mL/kg腹腔注射，每周注射1次。空白組注射等體積的蒸餾水，模型組注射等體積的配藥溶劑。

各組單籠孤養，每天隨機給予不同刺激，共21 d，包括：傾籠45°、潮濕墊料(24 h)、禁食(24 h)、夾尾(4 min)、禁水(24 h)、晝夜顛倒(24 h)、4 ℃冰水浴(5 min)、噪音(1 h)，每天隨機實施1種刺激且每種刺激5 d之內不重復。21 d后，各組大鼠分別進行行為學檢測。空白組每籠5只飼養，不給予任何刺激。

1.2.2 行為學檢測

1.2.2.1 糖水偏好實驗[6]:禁水12 h，測試期間給予每只大鼠一瓶1%蔗糖水和一瓶蒸餾水，分別測定大鼠1 h攝入1%蔗糖水、蒸餾水的重量，并計算糖水偏好度。計算公式為：糖水偏好度=糖水消耗/總消耗×100%)。

1.2.2.2 強迫游泳實驗：將大鼠置于玻璃圓柱體的水缸中(高、直徑分別為50 cm、20 cm)，水深約40 cm。實驗開始后適應1 min，采用小動物行為分析系統(西班牙Panlab，Smart3.0)記錄4 min內大鼠的游泳不動時間。

1.2.2.3 Morris水迷宮測試：實驗第19天開始對大鼠進行訓練，若1 min內未找到平臺，則將其牽引至平臺處停留20 s，學習持續4 d。第23天將大鼠從平臺正對的象限處面向池壁放入，采用小動物行為分析系統記錄其爬上平臺的時間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)；于第23天撤除平臺，由同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠穿越目標象限的次數(target quadrant)和目標象限的潛伏時間(latency time，Lat.T)。

1.2.3 血液及腦組織樣本的采集:腹主動脈取血，每組一半數量的大鼠血液采用抗凝管收集，另一半大鼠血液采用常規采血管放置直至凝血，3 000 r/min離心10 min，分別取上清-0 ℃冰箱保存。冰上取海馬組織后，立即放入液氮中速凍，再轉移至-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 ELISA檢測血液中CORT、5-HT、NE的含量：根據試劑盒說明書，采用ELISA測定各組大鼠血漿中皮質酮(corticosterone，CORT)及血清中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的含量。

1.2.5 Western blot檢測海馬中蛋白的表達：凍存的海馬中加入RIPA裂解液冰上勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min后取上清液，測定蛋白質含量，保存待用。配置15%濃縮膠與10%分離膠，上樣、電泳、轉膜、封閉，4 ℃過夜，加入相應的一抗，孵育，以GAPDH為內參。采用近紅外雙色激光成像系統測量吸光度值，計算各組目標蛋白的相對表達量，進行統計分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠糖水偏好度和強迫游泳不動時間的比較

與對照組比較，抑郁模型組大鼠蔗糖水偏食度顯著降低，游泳不動時間增加(P<0.01)；與模型組比較，GSK650394組大鼠蔗糖偏食度升高，不動時間顯著下降(P<0.01或P<0.05)(表1)。

表1 GSK650394對抑郁大鼠糖水偏好和不動時間的影響

2.2 各組大鼠Morris水迷宮測試結果比較

與對照組比較，模型組大鼠EL、Lat.T均顯著延長(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，GSK650394組大鼠的EL、Lat.T均顯著縮短(P<0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠血漿CORT含量的變化

與對照組比較，模型組的血漿CORT明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，GSK650394組可降低血漿CORT的含量(P<0.05)(表3)。

表2 GSK650394對各組大鼠水迷宮學習記憶的影響Table 2 Effect of GSK650394 on learning and memory in water maze test on rats in each

表3 GSK650394對血漿CORT含量的影響

2.4 各組大鼠血清5-HT、NE、BDNF的變化

與對照組比較，模型組的血清5-HT、NE、BDNF顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，GSK650394組可增加血清5-HT、NE、BDNF的含量(P<0.05或P<0.01)(表4)。

表4 GSK650394對血清5-HT、NE和BDNF含量的影響

2.5 各組大鼠海馬BDNF、NT-3、NGF表達的影響

與對照組比較，模型組海馬NT-3、BDNF、NGF表達明顯減少(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，GSK650394組大鼠海馬NT-3、BDNF、NGF表達明顯增加(P<0.01或P<0.05)(圖1,表5)。

圖1 GSK650394對海馬BDNF、NT-3、NGF表達的影響Fig 1 Effect of GSK650394 on the expression of BDNF, NT-3, NGF in hippocampus

表5 GSK650394對海馬BDNF、NT-3、NGF表達的影響

3 結論

目前，抑郁癥是最常見的精神疾病，且全球每年80萬自殺者中約有50%發生在抑郁癥患者中，與普通人群相比，進行性肌營養不良癥(major depressive disorder,MDD)患者死于自殺的風險高出20倍[7]。其特征是顯著且持續的情緒低落、興趣喪失、自尊低下、認知障礙、意志力下降和學習記憶能力減退等[8]。本研究結果表明，SGK1抑制劑GSK650394可顯著增加蔗糖水偏食度、降低游泳不動時間，縮短EL、Lat.T，說明SGK1抑制劑能顯著改善抑郁樣情緒行為。

應激所調控的糖皮質激素信號和抑郁癥存在復雜的交互關系已得到了廣泛的證實，即糖皮質激素與其受體結合后以二聚體形式轉位入核, 通過結合糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)反應元件促進SGK1基因的轉錄表達[9]。SGK1不僅是CORT信號系統的下游靶點, 而且能在無糖皮質激素的條件下潛在維持GR的活性，增強CORT的負面效應[10]。本研究結果表明，SGK1抑制劑能顯著降低血漿CORT的水平，提示GSK650394可有效阻斷機體HPA軸的高亢狀態。抑郁癥發生時，CORT水平升高以及HPA軸功能亢進是比較典型的病理學特征。應激引起的高水平CORT與GR結合后可活化肝臟酪氨酸氨基轉移酶和色氨酸吡咯化酶，降低血液中5-HT和NE前體的數量，繼而減少5-HT和NE的合成，加劇抑郁癥的發生發展[11-12]。本研究結果表明，SGK1抑制劑能顯著增加血清5-HT、NE的含量，提示GSK650394具有良好的抗抑郁功效，其發揮抗抑郁的功效可能與阻斷機體的持續應激高亢狀態，導致單胺遞質水平增加有關。

神經營養障礙是神經可塑性受損的關鍵基礎，且越來越多的證據表明抗抑郁治療可能通過增強神經營養保護神經元細胞的結構和功能并對突觸可塑性發揮有益作用。BDNF、NGF、NT-3被認為是神經營養素家族中的重要成員，其中BDNF已成為公認的抑郁癥診斷的生物標志物，在神經元的維持和存活、促進神經再生、加快突觸生長和突觸可塑性中均起到重要作用[13-14]。NGF可參與受損神經元的修復，并對病理狀態下海馬可塑性起到了重要的調節作用[15]。NT-3可調節神經干細胞的增殖和分化，并能促進神經祖細胞增殖分化為功能成熟的神經元[16]。研究表明，神經營養信號可直接或間接受到SGK1的調控[17]，SGK1可能通過影響BDNF等神經營養因子而發揮神經保護的作用。本實驗結果表明，GSK650394可上調海馬BDNF、NT-3、NGF的表達，說明SGK1抑制劑可能通過維持海馬神經元的增生和存活、促進神經干細胞的增殖和分化、加強神經營養的突觸可塑性等不同角度，共同發揮營養神經的功效。

綜上所示，SGK1抑制劑具有顯著的緩解抑郁樣行為及抑制HPA軸高亢的功效，其發揮抗抑郁的機制可能與促進海馬神經營養相關。