5-脂氧合酶激活蛋白抑制劑MK886對人食管癌細胞系增殖和凋亡的影響

史鐵偉， 李天柱， 周 靜， 娜日蘇，孫 琪，許麗艷，白春英*

(1.赤峰學院 基礎醫學院 內蒙古人類遺傳病研究重點實驗室，內蒙古 赤峰 024000；2.汕頭大學 醫學院 潮汕沿海地區高發腫瘤分子生物學廣東省高校重點實驗室，廣東 汕頭 515000)

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是人體必需的一種脂肪酸，其代謝產物與多種疾病的發生發展關系密切[1-2]，尤其在致癌過程的發生、發展及防治靶點中的重要作用引起越來越多科研人員的重視和關注[3-4]。5-脂氧合酶(5-lipoxygen-ase,5-LO)是花生四烯酸代謝途徑中關鍵的兩個限速酶之一，前期工作表明，5-LO的表達與鱗狀食管癌淋巴結轉移和pTNM分期(病理學上的TNM分期)顯著相關，5-LO表達的上調與疾病的晚期和食管癌(esoplageal sequamous cell carcinoma,ESCC)預后不良有關[5]。在5-LO代謝通路上，需要5-脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase activating protein,FLAP)傳遞花生四烯酸并激活5-LO，隨后引起的一系列生理變化，包括炎性細胞趨化因子白三烯B4的合成，可見FLAP在該代謝通路的重要性。

MK886作為FLAP的抑制劑，通過上皮細胞間充質轉化，對肝母細胞瘤[6]和卵巢癌[7]均有一定的抗腫瘤作用。雖然前期研究發現5-LO和食管癌的發生及惡化關系密切，成正相關。然而FLAP在食管癌中的作用分子機制尚不清楚，MK886在食管癌中對于抗腫瘤效果如何仍然不明確。本研究探討MK886對人食管癌細胞系KYSE-150和TE-3的細胞功能影響，以及可能的作用機制。為臨床食管癌的發病機制和腫瘤藥物使用提供進一步實驗依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌細胞系KYSE-150和TE-3(中科院上海細胞庫)；RMPI-1640培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(Hyclone公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；兔抗人caspase-3、cleaved-caspase-9、LC3A/B、PARP等抗體(CST公司)；鼠抗人β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗(Santa Cruz公司)；ECL試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白質濃度測量、蛋白質印跡有關試劑(Bio-Rad公司)；青霉素-鏈霉素溶液(100×)以及蛋白質提取相關試劑(上海碧云天生物技術有限公司)；PI/RNase Staining Buffer(BD公司)；MK886(Tocris Bioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養：將人食管癌細胞系KYSE-150和TE-3均分別用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基培養，內含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。當細胞匯合率為70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養；觀察細胞增殖狀態和培養液顏色換液傳代。此2種細胞均貼壁增殖，后續實驗如無特殊說明均使用對數期細胞。

1.2.2 RTCA分析儀檢測細胞增殖：將MK886抑制劑粉末10 mg用DMSO溶解成100 mmol/L母液備用(-20 ℃不超過1個月)，使體外實驗DMSO的終體積分數不高于0.05%。應用RTCA分析儀(xCELLigence RTCA系統)檢測細胞增殖，在E-plate每孔放入5 000個細胞。程序設定加藥物前每30 min檢測1次細胞增殖情況，加入藥物后每10 min檢測1次細胞增殖情況(表1)。

表1 xCELLigence RTCA系統運行程序

放置細胞培養過夜，然后，每孔加入5 μL的MK886藥物使得最終濃度分別為2.5、5、10、20、40和80 μmol/L(藥物母液用無血清培養基稀釋)，跳過程序2，從程序3開始持續監測數據，處理48 h，記錄試驗結果，分析數據同時確定半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentra-tion，IC50)。

1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞周期：藥物處理細胞后，分不同時間收集，加入PBS，500×g離心5 min，洗滌不同處理后細胞，棄上清。加入1 mL 70%預冷乙醇(-20 ℃保存)中，吹打均勻，4 ℃固定在試管里18 h以上。500×g離心5 min，小心棄上清，將試管小心倒扣在濾紙上，吸盡酒精，彈起細胞。加入0.5 mL PI/RNase染色液，充分混勻細胞后，37 ℃孵育15 min。分析前4 ℃避光保存樣本，1 h內上流式細胞儀BD-C6檢測細胞周期，結果分析并繪制圖(繪圖結果只顯示G0/G1、S和G2/M期，G1CV和G2/M CV不顯示)。

1.2.4 蛋白質印跡法檢測細胞中的caspase-3、cleaved-caspase-9、LC-3A/B和PARP蛋白表達：確定IC50后，分別收集0、12.5、25和50 μmol/L的MK886處理48 h后的食管癌細胞。以DMSO處理作為對照組，用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度；40 μg上樣量，進行10% SDS-PAGE，電泳分離后的蛋白質移至PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉封閉液置于室溫封閉2 h，分別加入一抗caspase-3、cleaved-caspase-9、LC-3A/B、PARP(稀釋比例為1︰500)和β-actin(稀釋比例為1︰1 000)，4 ℃過夜；TBST洗膜3次，10 min/次，加入二抗(稀釋比例為1︰5 000)，37 ℃反應1 h；TBST洗膜3次，10 min/次，按照ECL試劑盒說明進行顯影。Alpha成像設備拍照，分析。以目的蛋白和內參蛋白β-actin吸光值的比值，計算目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MK886抑制KYSE-150和TE-3細胞的增殖

與0 μmol/L組比較，不同濃度MK886處理KYSE-150和TE-3細胞48 h后，隨著MK886濃度增加，細胞增殖受到不同程度的抑制(圖1)。

2.2 MK886對食管癌細胞毒性實驗的影響

xCELLigence RTCA實時檢測系統計算MK886處理KYSE-150和 TE-3的IC50值為29.11和27.47 μmol/L。KYSE-150和TE-3的藥物處理濃度設置為12.5、25和50 μmol/L 3種濃度，處理時間為48 h(圖2)。

*P<0.05, **P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖1 MK886對KYSE-150和TE-3細胞增殖的影響Fig 1 Effects of MK886 on proliferation ability of KYSE-150 and TE-3

圖2 xCELLigence RTCA系統實時檢測MK886對KYSE-150和TE-3細胞藥物毒性試驗計算IC50

2.3 檢測MK886對食管癌細胞周期的影響

與0 μmol/L組比較，食管癌細胞系KYSE-150和TE-3細胞隨著MK886處理濃度的增加，出現了G0/G1期滯后增加明顯(P<0.001)；MK886處理濃度增加到50 μmol/L，G2/M期增加明顯(P<0.001和P<0.01)(圖3)。

2.4 MK886對食管癌細胞凋亡和自噬蛋白表達的影響

與0 μmol/L組比較，食管癌細胞系KYSE-150和TE-3細胞隨著MK886處理濃度的增加，cleaved-caspase-3和LC-3A/B-Ⅱ蛋白表達增強(P<0.001)(圖4)。

3 討論

除了參與炎性反應的發生以外，越來越多證據表明5-LO代謝通路與腫瘤的發生、發展關系密切[8-9]。5-LO除了參與白三烯經典功能外，在促炎性消退脂類介質(specialized pro-resolvinglipid mediators，SPM)的生物合成中的重要作用越發引起人們重視[10-11]，尤其腫瘤炎性微環境中SPM可以減少促炎、促腫瘤介質的產生，包括調動人體對腫瘤的免疫應答，從而抑制腫瘤的發生以及發展。由于FLAP在5-LO代謝通路起關鍵調節蛋白作用，MK886作為FLAP的抑制劑，可以阻斷白三烯的產生，提示人們FLAP抑制劑作為癌的化學預防劑有巨大潛力[12]。

自噬(autophagy)是一種真核細胞的生存機制，尤其在腫瘤發生和發展的過程中，細胞自噬的作用顯示了兩面性和機制復雜性[13]。本研究利用MK886處理人食管癌細胞系KYSE150和TE3，采用xCELLigence RTCA系統實時監測細胞增殖情況，發現MK886明顯抑制食管癌細胞系的增殖。流式細胞儀檢測發現藥物處理濃度增加至25 μmol/L，食管癌細胞G0/G1期滯后增加明顯，MK886處理濃度增加到50 μmol/L，食管癌細胞G2/M期增加明顯，提示不同濃度MK886處理食管癌細胞系影響其細胞周期的變化機制不完全一致，需要進一步研究。蛋白質印跡檢測MK886處理后食管癌細胞系隨著濃度增加， caspase-3和LC-3A/B-Ⅱ蛋白表達增強，說明不同濃度的MK886對食管癌細胞通過caspase-3途徑發揮凋亡機制，高濃度的MK886會引起食管癌細胞系發生自噬消除藥物影響。

*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖3 不同濃度MK886對食管癌細胞系周期的影響

*P<0.05, **P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖4 不同濃度MK886對食管癌細胞系凋亡和自噬蛋白表達的影響

綜上所述， MK886可以抑制食管癌細胞系的增殖，引起細胞凋亡，其機制可能涉及不同細胞周期通路變化和caspase-3凋亡途徑。高濃度處理后細胞表現的自噬現象提示須注意臨床用藥的劑量控制，防治細胞自噬發生從而產生耐藥性。MK886作為食管癌的化學預防劑潛力較大，FLAP有望成為食管癌預防和治療的潛在靶點。