特異性壞死性凋亡抑制劑-1(Nec-1)減輕脊髓損傷模型大鼠膠質(zhì)瘢痕的形成

陳 勝，王春明，嚴(yán)雪飛，毛淵青

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院盛澤臨床醫(yī)學(xué)院 骨科， 江蘇 蘇州 215228)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可導(dǎo)致機(jī)體運動功能和感覺功能喪失，甚至造成死亡，對患者造成極大危害[1]。膠質(zhì)瘢痕是脊髓損傷后，由星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞形成的一種邊界結(jié)構(gòu)，在脊髓損傷后期阻礙神經(jīng)元軸突的延伸和神經(jīng)軸索的再生，抑制神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，對脊髓損傷的恢復(fù)有重要意義。脊髓損傷后細(xì)胞會發(fā)生程序性死亡，細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白顯著增加[2]。Cathepsin B是一種半胱氨酸蛋白水解酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝。Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要參與者，在局灶性腦梗死中發(fā)現(xiàn)cathepsin B可調(diào)控caspase-3蛋白酶，擴(kuò)大細(xì)胞凋亡[3]。減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，可以抑制瘢痕的形成。特異性壞死性凋亡抑制劑-1(necroptosis inhibitor-1/necrostatin-1,Nec-1)是小分子堿類物質(zhì),是程序性壞死的特異性抑制劑，在細(xì)胞的死亡和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本文觀察Nec-1對脊髓損傷大鼠模型膠質(zhì)瘢痕形成的影響，及其抑制瘢痕形成的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD雌性大鼠，體質(zhì)量180～200 g{廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SYXK(粵)2016-0158]}。進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后用于研究。本研究遵循《實驗動物管理條例》。

1.1.2 主要試劑：Nec-1抗體、caspase-3抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體和波形蛋白(vimentin)抗體(Abcam公司)；cathepsin B抗體(Bioss公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔二抗(北京博爾西科技有限公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組(采用改良Allen的重物墜落法[4])和Nec-1組(在大鼠側(cè)腦室注射10 μmol/L Nec-1溶液10 μL)，每組18只。

1.2.2 后肢運動評分及評價：用國際公認(rèn)的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)進(jìn)行評分，并用雙盲法評價大鼠后肢運動功能。

1.2.3 免疫熒光檢測膠質(zhì)瘢痕的形成：取各組小鼠傷段的脊髓組織，制作冰凍切片，在37 ℃進(jìn)行封閉1 h，加入GFAP一抗(1∶200)于4 ℃過夜，PBS清洗，加二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，PBS清洗3次后封片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行軟件分析GFAP陽性率，GFAP陽性率=GFAP染色面積/組織總面積。

1.2.4 Western blot檢測傷段脊髓組織cathepsin B、caspase-3、GFAP和vimentin蛋白水平：快速取出組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于液氮中保存。提取組織總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAEE，轉(zhuǎn)膜、加一抗(1∶1 500)在4 ℃孵育過夜，次日，洗膜加二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后，加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實驗組大鼠后肢運動功能BBB評分

與假手術(shù)組相比，模型組及Nec-1組BBB評分值均顯著降低(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組BBB評分值顯著升高(P<0.05)(表1)。

2.2 各組膠質(zhì)瘢痕的形成

與假手術(shù)組相比，模型組7和14 d，Nec-1組GFAP陽性率顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組GFAP陽性率顯著降低(P<0.05)(圖1，表2)。

表1 各組大鼠后肢運動功能BBB評分Table 1 BBB score of hind limb motor function of rats in each

圖1 免疫熒光檢測大鼠脊髓組織GFAP表達(dá)Fig 1 Expression of GFAP in rat spinal cord was detected by immunofluorescence

表2 各組大鼠脊髓組織GFAP陽性表達(dá)率Table 2 Positive expression rate of GFAP in spinal cord of rats in each

2.3 脊髓組織GFAP及vimentin蛋白的表達(dá)

術(shù)后第7及14天，與假手術(shù)組相比，模型組及Nec-1組GFAP和vimentin蛋白顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組GFAP和vimentin蛋白顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.4 脊髓組織cathepsin B和caspase-3的表達(dá)

術(shù)后第7天、14天，與假手術(shù)組相比，模型組、Nec-1組cathepsin B、caspase-3蛋白顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組cathepsin B、caspase-3蛋白顯著降低(P<0.05)(圖3)。

3 討論

脊髓損傷分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，前者對脊髓組織造成機(jī)械性損傷， 后者多伴隨著神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和炎性反應(yīng)等[5]。控制脊髓的繼發(fā)性損傷，可以減少神經(jīng)元壞死，促進(jìn)神經(jīng)軸突再生。Nec-1是程序性壞死的特異性抑制劑，小鼠脊髓損傷后，Nec-1通過抑制受體相關(guān)蛋白1(receptor interacting protein-1,RIP1)和RIP3的相互作用，減輕脊髓繼發(fā)性損傷[6]。Nec-1可有效減少小鼠腦組織缺損，促進(jìn)活動功能和學(xué)習(xí)能力。本研究表明，術(shù)后模型組和Nec-1組BBB評分值降低，Nec-1組BBB評分值升高，提示Nec-1可促進(jìn)脊髓損傷小鼠后肢運動功能的恢復(fù)。

A：GFAP protein expression；B：vimentin protein expression， a.sham， b.model， c.Nec-1; *P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with model group

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后，GFAP的表達(dá)量反映星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況[7]。抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，可促進(jìn)大鼠脊髓損傷恢復(fù)。中間絲波形蛋白(vimentin)是星形膠質(zhì)細(xì)胞增生一種重要標(biāo)志，脊髓損傷后，膠質(zhì)瘢痕的形成與GFAP和vimentin的表達(dá)增加有關(guān)[8]。抑制GFAP和vimentin蛋白表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，對脊髓損傷修復(fù)有重要作用[8]。本研究表明，術(shù)后第14天，模型組和Nec-1均可見NF-200熒光，與模型組相比，Nec-1組NF-200熒光標(biāo)記強度降低，提示Nec-1干預(yù)可減少脊髓損傷大鼠瘢痕組織形成。進(jìn)一步還觀察到，模型組及Nec-1組大鼠脊髓組織中GFAP和vimentin表達(dá)升高，Nec-1組GFAP和vimentin表達(dá)降低，提示Nec-1可能降低脊髓損傷大鼠脊髓組織GFAP和vimentin蛋白表達(dá)。

A.cathepsin B protein expression；B.caspase-3 protein expression；a.sham；b.model；c.Nec-1; *P<0.05 compared with sham group； #P<0.05 compared with model group

細(xì)胞凋亡是脊髓的繼發(fā)性損傷的主要癥狀之一，caspase家族是細(xì)胞凋亡中的調(diào)控因子[9]。Cathepsin B在神經(jīng)細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，促進(jìn)caspase活化，引起細(xì)胞凋亡，Nec-1通過下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，有效緩解小鼠癲癇[10]。本研究表明，在脊髓損傷術(shù)后第7天和14天，模型組和Nec-1組cathepsin B及caspase-3蛋白表達(dá)均升高，與模型組相比，Nec-1組cathepsin B和caspase-3蛋白表達(dá)降低，與文獻(xiàn)報道[11]一致。提示Nec-1可抑制脊髓損傷大鼠脊髓組織中cathepsin B和caspase-3表達(dá)。

調(diào)控cathepsin B和caspase-3的表達(dá)，抑制脊髓損傷大鼠膠質(zhì)瘢痕形成，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。其具體作用機(jī)制尚需深入研究。