基因治療中的核酸藥物及非病毒遞送載體的研究進展

劉 健

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院，北京 100005)

人類的很多疾病都與基因有著密切的關系，基因治療是在核酸水平上對細胞生理機能進行干預的治療技術，可通過導入正常基因以替代缺失或異常突變的基因，或抑制非正常的內源性基因的功能，對基因異常所導致的疾病進行治療。此外，通過核酸水平的調控可以對目標細胞進行工程化改造，在原位產生有益的功能性蛋白[1]，從而實現基因-細胞聯(lián)合治療，這一策略在再生醫(yī)療、 免疫治療、 RNA疫苗等領域具有重要的價值。

用于基因治療的核酸類藥物通常會編碼特定的蛋白，或基于堿基互補原理對靶標基因進行調節(jié)。與傳統(tǒng)小分子化學藥物和抗體類藥物相比，基于序列的核酸藥物設計更為簡單方便，而且受成藥靶點的限制較少，對胞內和胞膜上的蛋白均可發(fā)揮作用。此外，在哺乳動物的基因組中，只有大約不足3%的DNA會最終表達為蛋白，而大量的非編碼RNA(noncoding RNA)也在生命活動的調節(jié)中發(fā)揮著重要作用，因此，以核酸分子為靶標的核酸藥物擁有更廣的作用范圍。但是，核酸類藥物的臨床應用面臨很多的障礙，如體內穩(wěn)定性差、難以高效進入靶細胞等。要發(fā)揮核酸藥物的作用，通常需要利用合適的載體幫助核酸藥物進入目標細胞并到達特定的胞內位置。因此，開發(fā)安全、高效的核酸遞送系統(tǒng)是基因治療成功的基石。

1 基因治療中的核酸藥物

核酸藥物分為DNA藥物和RNA藥物，主要包括質粒DNA(plasmid DNA，pDNA)、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、小RNA(microRNA，miRNA)、短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)等[2]。近年來核酸藥物獲得批準的速度明顯加快，其適應癥也更加廣泛，已有不同類型的核酸藥物進入臨床試驗階段，有望成為繼小分子化學藥物和抗體藥物后的第三大類型藥物。

1.1 基于RNA干擾的核酸藥物

RNA干擾技術在2001年被《Science》雜志評為當時的十大科學進展之一。自1998年研究人員首次發(fā)現雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)現象以來，基于RNA干擾治療方法的研究逐漸成為熱點。RNAi是真核生物抵御外源基因入侵的一種天然防御機制，可以抵御病毒感染和轉座子的插入。同時，RNAi也能夠調控基因表達。迄今已發(fā)現siRNA、miRNA和shRNA可通過介導靶標mRNA的降解或抑制mRNA翻譯，實現序列特異性的靶基因敲除。RNA藥物的優(yōu)點是不需要向細胞核內傳遞，插入宿主基因組的風險低，主要缺點是穩(wěn)定性低和較高的免疫原性風險。

在可介導RNAi的各種核酸分子中，siRNA是最常見的一類。siRNA是一種雙鏈RNA，長度一般在21～23個核苷酸左右，可以直接導入細胞，也可由長雙鏈RNA或shRNA在胞內通過核酸酶Dicer切割生成。進入胞內的siRNA會與Argonaute蛋白及Dicer組成沉默復合物(RISC)，并解開成為單鏈。之后可以引導RISC識別并切割與其互補的靶mRNA序列，使其降解，從而導致特定靶基因的敲除[3]。2018年8月10日，美國食品和藥物管理局(FDA)批準了第一個siRNA藥物patisiran(Onpattro)，它是一種作用于肝臟的siRNA，用于治療遺傳性轉甲狀腺蛋白淀粉樣變性(hATTR)引起的多發(fā)性神經病[4]。2019年11月第二款RNAi藥物givlaari獲得批準進入臨床，用于治療急性肝性卟啉癥(AHP)[5]。2020年有兩款新的siRNA藥物獲得批準，分別用于原發(fā)性高草酸尿癥[6]及成人高膽固醇血癥的治療[7]。此外，還有用于肝臟、腎臟和眼部適應癥的多種siRNA候選藥物正處于臨床試驗的不同階段。siRNA藥物屬于人工制備的外源性siRNA，其主要問題是進入機體后可能會引起免疫反應，導致干擾素及炎性因子的產生，或由于“脫靶效應”而導致正常功能基因的表達沉默。通過對鏈端或核苷進行適當的化學修飾(如反義鏈5’端的甲氧基化修飾等)，可在一定程度上減少這些不良事件的發(fā)生。

除siRNA外，單鏈的miRNA也可以調節(jié)mRNA的翻譯，進而調節(jié)細胞的分化、增殖等過程，目前已發(fā)現約2 000種內源miRNA。miRNA的異常與腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關[8]。miRNA藥物可分為拮抗劑(antagonist)及模擬物(mimics)兩類。前者通過堿基互補配對與內源miRNA結合，并通過RISC對miRNA進行降解或阻礙其翻譯，從而抑制其功能；后者的序列與人體內具有正常功能的miRNA類似，將其導入miRNA缺失的靶細胞，可使細胞恢復正常生理功能。盡管自miRNA發(fā)現至今已有約20年的時間，有部分miRNA藥物的研發(fā)已進入臨床試驗階段，但尚未有藥物獲得批準進入臨床使用。

1.2 基于反義核酸技術的核酸藥物

反義核酸包括反義RNA和反義DNA，是指能與特定mRNA或DNA精確互補，從而特異阻斷其翻譯或轉錄的核苷酸片段。反義RNA與靶標mRNA結合后，通過空間位阻效應阻止核糖體與mRNA結合，或抑制轉錄后mRNA的加工修飾，并能夠激活內源性RNase降解mRNA，從而抑制靶蛋白的翻譯；反義DNA通過與基因DNA雙鏈的調控區(qū)特異結合形成DNA三聚體(triplex)，或與DNA編碼區(qū)結合，從而抑制轉錄的順利進行。目前應用最多的反義核酸藥物是包含15～25個核苷酸的單鏈寡聚核苷酸(ASO)，自1978年被報道之后，已有多款藥物被批準用于杜氏營養(yǎng)不良癥、家族性高膽固醇血癥、脊髓性肌萎縮癥等疾病的治療，是當前獲得批準藥物數量最多的一類核酸藥物[9]。

1.3 編碼蛋白的核酸藥物

質粒是應用最廣泛的一類基因導入工具，多為環(huán)形雙鏈DNA，存在于胞質中，能夠自行復制，是細胞內獨立于染色體外的遺傳物質。相對于借助病毒的基因導入技術，質粒具有易于生產、免疫原性低、安全穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點，使其成為基因治療中極為重要的一類藥物。自1995年以來，獲得批準的基因治療試驗方案中大約有25%使用了質粒DNA[10]。質粒不僅可以編碼蛋白，也可以編碼mRNA、miRNA或siRNA等其他功能性RNA藥物，甚至可以同時編碼多種不同類型的藥物，從而能為基因治療提供更多的選擇方案。但是，質粒DNA通常分子尺寸較大，這為其向胞內的遞送增加了一定的困難。

另一種在細胞內表達功能性蛋白的方法是利用mRNA。與質粒相比，直接將編碼特定蛋白的mRNA轉入細胞，可以跨過轉錄步驟直接進行翻譯表達，對于只需要一過性蛋白表達的場合更加直接方便。在COVID-19疫情暴發(fā)之后，基于mRNA的核酸疫苗技術在疫情防控中發(fā)揮了重要的作用，充分顯示了mRNA疫苗在時效性及有效性上的優(yōu)勢。基于mRNA疫苗技術的mRNA-1273是全球最先進入臨床試驗的新冠疫苗，Ⅲ期臨床的最終分析數據顯示，其對COVID-19的保護效力能達到94%；另一款mRNA疫苗BNT162b2在Ⅲ期臨床中同樣顯示了對COVID-19高達95%的保護效力[11-12]。此外，在腫瘤免疫治療領域，個性化癌癥疫苗mRNA-4157與檢查點抑制劑療法的結合在多種實體腫瘤中顯示了良好的抗癌潛力，在Ⅰ期臨床中對頭頸部鱗狀細胞癌的的總緩解率(ORR)達到50%，而單獨使用檢查點抑制劑治療的ORR僅有14.6%[13]。

1.4 基于基因編輯技術的核酸藥物

通過基因編輯技術對細胞進行改造可能是實現基因長期穩(wěn)定表達或完全敲除的最佳手段之一。用于基因編輯的工具主要包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription-activator like effector nuclease, TALEN)和 CRISPR/Cas系統(tǒng)。其中CRISPR/Cas系統(tǒng)在效率、速度和成本方面均具有明顯優(yōu)勢，可以在人類基因組中引入精確的編輯，特別是CRISPR/Cas9作為核酸藥物的應用研究最為廣泛，被用于CAR-T細胞治療、高膽固醇血癥、鐮狀細胞貧血、地中海貧血和杜氏肌營養(yǎng)不良等多種疾病的治療[14-15]。

與其他單一核酸藥物不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)至少需要將引導RNA(gRNA)和Cas9核酸酶兩個組件(進行基因插入時還需要模板RNA)按一定比例傳遞到細胞中才能發(fā)揮最佳的基因編輯效率，實現基于非病毒載體的安全高效遞送非常具有挑戰(zhàn)性[16]。CRISPR/Cas除了可以直接使用Cas蛋白，還可以選擇使用編碼Cas蛋白的mRNA，或者使用同時編碼Cas和gRNA的單個質粒，在胞內通過轉錄/翻譯轉化為具有活性的gRNA及Cas核酸酶[17]。有研究報道利用帶有二硫鍵的脂質納米顆粒(BAMEA-O16B)在體內遞送Cas9 mRNA和sgRNA可實現約80%的高編輯效率[18]。

2 核酸藥物載體

核酸藥物在體內的應用面臨多重挑戰(zhàn)。首先，由于體內存在大量核酸酶，核酸分子很容易被降解，難以單獨進行全身性給藥，極大影響了核酸藥物的成藥性。其次，核酸藥物必須進入細胞質或細胞核才能發(fā)揮作用，而核酸分子尺寸通常較大，親水性很好，且因分子鏈中存在大量磷酸根，在正常生理pH條件下帶負電荷，很難穿透細胞膜進入細胞。因此，核酸藥物遞送載體及相關遞送技術的發(fā)展是基因治療技術實現臨床應用的重要基礎。

核酸載體一般可分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類。常見的病毒性載體包括腺相關病毒、慢病毒、腺病毒和逆轉錄病毒等，由于利用了野生型病毒固有的能力，因而可以高效轉染細胞[19]。目前大多數的細胞和基因治療項目所采用的載體都是病毒載體。但病毒載體對核酸分子的尺寸有限制，而且需要復雜的制備過程，成本較高，更重要的是可能存在免疫原性、致癌性等安全隱患[20]。非病毒載體具有更高的安全性，但其缺點是轉染效率較低。近年來，隨著轉染效率、特異性和安全性的改進，臨床試驗中非病毒載體的數量逐漸增加[21]。常見的非病毒載體包括陽離子脂質、陽離子高分子和多肽等，這些陽離子型的載體在正常生理pH條件下帶正電荷，可以與帶負電荷的核酸分子形成復合體，通過對核酸分子進行壓縮而減小其分子尺寸，并提供足夠的保護以對抗核酸酶。同時，復合體表面多余的正電荷可以使復合體更容易接近帶負電荷的細胞膜，促進核酸分子進入細胞，并可通過質子海綿效應幫助被內吞的核酸分子從溶酶體中逃逸而進入胞質(圖1)，這一理論近年來已得到了一些影像學證據的支持[22]。

圖1 陽離子型載體介導的基因轉染Fig 1 Gene transfection mediated by cationic carriers

2.1 陽離子脂質

陽離子脂質易于合成且轉染過程相對簡單，是最常見的一類非病毒基因遞送載體。盡管用于基因遞送的陽離子脂質分子具有不同的化學結構，但從結構上看，基本都由極性頭基、疏水尾部和連接子構成。最普遍的陽離子頭基是各種胺基，而疏水尾部則通常由脂肪鏈或膽固醇等組成，疏水結構域與極性頭基之間由酯鍵、醚鍵等連接。每一個結構域在核酸藥物的傳遞過程中都起著關鍵作用，且都可以通過適當地調整來優(yōu)化載體的性能，例如，通過改變連接子，可調控脂質分子的穩(wěn)定性、轉染效率和生物相容性[23]。陽離子脂質可以通過靜電吸附及自組裝與核酸分子形成脂質/核酸復合物，保護核酸分子和促進內吞，并幫助核酸分子從溶酶體逃逸，其轉染效率取決于脂質類型、構成及脂質/核酸電荷比[24]。雖然單一成分的陽離子脂質也可以作為核酸載體，但更普遍的方法是與二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和膽固醇等輔助脂質配合使用，以調節(jié)脂質體的穩(wěn)定性，幫助脂質/核酸復合物的形成，并促進脂質體與細胞膜的相互作用[25]。

2.2 脂質納米顆粒

脂質納米顆粒(LNP)是另一種廣泛使用的非病毒基因遞送載體，易于加工并可穩(wěn)定儲存，與陽離子脂質具有相近的轉染效率，并且易于通過功能化修飾而提高細胞靶向、內化及介導基因轉染的能力[11-12]。球狀囊泡結構的LNP多由可電離的陽離子脂質(ionizable lipids)、中性輔助脂質、膽固醇、聚乙二醇修飾的脂質(PEGylated lipid)構成。如首個mRNA疫苗mRNA-1273所使用的載體由一種可電離陽離子脂質(SM-102)與三種商業(yè)化脂質(DSPC、膽固醇和PEG2000-DMG)組成[26]。成分中的中性輔助脂質一般為飽和磷脂，能促進層狀脂質結構的形成及穩(wěn)定；膽固醇有較強的膜融合性，可促進mRNA內化和進入胞質；PEG化脂質用于免疫逃逸和增加穩(wěn)定性；最關鍵的可離子化脂質在生理pH值下保持中性，以降低其毒性和免疫原性；在低pH值下則帶正電荷，從而能通過靜電力與核酸相互作用，并在被細胞內化后實現溶酶體逃逸。國際上首個獲得批準的RNAi治療藥物也同樣使用了脂質納米顆粒[27]。此外，脂質納米顆粒可以用來遞送CRISPR/Cas9組分，在動物模型體內實現了基因組編輯[28]。目前批準的脂質納米顆粒在儲存運輸和使用等方面還存在不足之處，比如需要在低溫下才能長期保存。

2.3 陽離子聚合物

基于合成或天然陽離子聚合物(CP)的核酸遞送系統(tǒng)在基因治療技術開發(fā)中受到大量關注。常見的包括聚乙烯亞胺(PEI)、多聚賴氨酸(PLL)、殼聚糖等。CP具有較高的正電荷密度，可與帶負電荷的核酸分子相互作用，對核酸分子進行壓縮，形成尺寸較小的聚電解質復合物(PIC)[29]；同時，可以提供強大的pH緩沖能力，有利于復合物從內體逃逸[22]。除了線性高分子外，樹枝狀聚酰胺胺(PAMAM)、聚丙烯亞胺(PPI)等具有納米尺度和徑向對稱性的三維樹狀結構大分子也經常被用于核酸藥物載體，其優(yōu)勢在于可以通過吸附介導的細胞內吞作用促進內化，通過表面胺基有效壓縮核酸并保護其不被酶降解，同時通過核心大量的三級胺基提供pH緩沖能力[30]。

PEI、PDMAEMA和PLL等常用CP都是不可降解的，且具有較強的細胞毒性，從而嚴重限制了其應用。通常認為CP細胞毒性與其分子尺寸及正電荷密度相關[31]。具有高分子量和電荷密度的非降解性CP可能在細胞中積累，最終導致高細胞毒性；而低分子量及低電荷密度的CP雖然更易于被清除，毒性較低，但會降低其壓縮核酸分子的能力，影響轉染效率。如低分子量PEI(～600 Da)毒性較小，但其轉染效率遠低于常被作為金標準的25 kDa支鏈PEI。因此，如何在毒性及轉染效率間取得平衡是CP設計所面臨的主要問題。Ding等通過在可生物降解的聚乳酸(PLA)分子上導入支鏈PEI合成了PEI-PLA共聚物，克服了PEI的毒性和不可降解的缺點，在有血清存在的情況下仍顯示了較高的轉染效率[32]。此外，Wu等將含有組氨酸和賴氨酸的連接子(linker)與低分子量PEI (600 Da)分子偶聯(lián)，合成了高分子量共聚物，使其獲得了較低的毒性及較高的轉染效率[33]。

另一種策略是使用可生物降解的聚合物，特別是明膠、白蛋白、殼聚糖(CS)、透明質酸(HA)、葡聚糖和β-環(huán)糊精(β-CD)等天然來源的蛋白或多糖分子[34]。這些生物可降解高分子在生物相容性方面具有較好的優(yōu)勢，而且具有與特定組織或細胞的天然親和性，如腫瘤細胞高表達HA受體，肝臟細胞高表達脫唾液酸糖蛋白受體等，因此可以實現一定的靶向遞送效果。由于多數天然高分子缺乏足夠的正電荷，為了負載核酸分子，通常需要進行陽離子化改性[35]。除了利用CP與核酸分子的自組裝作用，還可以利用預先制備的具有特定尺寸及空間結構的高分子基納米材料(如顆粒、凝膠、膠束等)來負載核酸分子，并實現被動靶向、環(huán)境響應、緩控釋等功能[36]。此外，使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等非正電性的納米顆粒來裝載DNA質粒等核酸藥物有可能避免陽離子帶來的細胞毒性[37]。

2.4 無機納米顆粒

無機納米顆粒種類繁多，金納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、磁性納米顆粒、碳納米管、量子點等材料已得到了大量的研究[38]。無機納米顆粒易于進行表面修飾改性，由此可對其降解性、生物相容性、免疫原性、核酸負載能力等進行優(yōu)化。除了可以負載核酸分子，無機納米顆粒通常具有獨特的多功能性，使其介導的基因遞送成為一種有吸引力的策略。如量子點在進行核酸遞送的同時，可以作為一種高效的熒光探針，實現核酸標記和體內動態(tài)分布的實時跟蹤[39]；氧化鐵磁性納米顆粒可在磁場作用下更高效地接近并進入細胞，實現高效的磁轉染(magnetofection)[40]，還可以實現磁誘導的細胞/組織靶向及磁共振成像[41]；此外，金納米顆粒的光熱效應使其可以觸發(fā)核酸藥物的釋放[42]，或實現光熱/基因聯(lián)合治療[43]。

2.5 外泌體

外泌體是由細胞自然分泌的胞外囊泡，直徑一般為40～160 nm，具有脂質雙分子膜結構，內部含有蛋白質、脂類、DNA和RNA等細胞成分。外泌體是細胞間通訊的紐帶，可以包裹胞內生成的信息素并將其傳送到其他細胞內，從而控制細胞集落有序生長。因此，外泌體不僅具有生物相容性，而且不易被免疫清除，使其具有作為基因傳遞載體的天然優(yōu)勢[44]。與脂質體相比，外泌體的組成更為復雜，而且脂膜富含蛋白質，能夠實現特異性靶向，并具有更高的穩(wěn)定性。然而，由于外泌體的生產及分離純化較為繁復困難，限制了其作為基因傳遞載體的廣泛應用[45]。

2.6 核酸偶聯(lián)物

與脂質及高分子復合物等載體系統(tǒng)相比，核酸藥物與膽固醇、多肽、抗體、核酸適配體或各類小分子直接連接形成的核酸偶聯(lián)物具有體積較小、免疫原性較低、不易被機體清除的特點，且可通過偶聯(lián)分子改變核酸藥物的體內分布及代謝動力學等性質，幫助核酸進入到特定的組織和細胞內[46]。核酸偶聯(lián)物中最成功的是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)修飾介導的肝靶向遞送系統(tǒng)，其可與肝細胞上高表達的脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體結合，介導高效率的內吞作用。目前已有3款基于GalNAc技術的核酸藥物獲得批準進入臨床應用[47]。但核酸偶聯(lián)物中的核酸分子通常缺少必要的保護，如何增強核酸分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性是其面臨的關鍵問題。研究表明，通過在核苷酸的2’位置進行化學修飾，以及用硫代磷酸鍵取代磷酸二酯鍵等方法，可大幅改善核酸偶聯(lián)物對核酸酶的穩(wěn)定性[48]。此外，分子間連接子的設計及修飾位置也是重要的因素。如采用環(huán)境敏感的linker，還可以使核酸偶聯(lián)物進入細胞之后與偶聯(lián)物脫離；在siRNA中心部位導入偶聯(lián)分子會獲得更為有效的RNA干擾效果[49]。

3 影響核酸藥物遞送效率的關鍵問題和對策

基因治療的成功與否，很大程度上依賴于能否以安全的方式將核酸藥物有效輸送到體內的目標細胞中。根據靶器官和給藥途徑的不同，核酸藥物及其載體需要克服多重生物學屏障[50]，整個過程中仍存在大量的關鍵性技術難點。

3.1 增強核酸藥物的穩(wěn)定性，增加體內循環(huán)時間

核酸藥物需要保證在未降解情況下到達目標器官/組織/細胞。但由于各類核酸酶的存在，核酸分子在體內環(huán)境中的半衰期非常短。通過對核糖、磷酸骨架、堿基以及核酸鏈末端等進行化學修飾可增加核酸藥物的穩(wěn)定性[48]。此外，利用陽離子脂質、陽離子高分子的壓縮和包裹也可以較好地實現對核酸分子的保護[29]。

核酸復合物在細胞外環(huán)境中不穩(wěn)定性和網狀內皮系統(tǒng)介導的免疫清除也是非病毒基因載體面臨的問題。引入DOPE和膽固醇等中性輔助脂類可以增強陽離子脂質/DNA復合物的膠體穩(wěn)定性[25]。此外，聚乙二醇修飾可以減少納米顆粒的聚集，提高其穩(wěn)定性，并可顯著提高非病毒基因載體的免疫逃逸能力，使其不易被網狀內皮系統(tǒng)清除[51]。除了陽離子高分子，親水性的中性聚合物如聚乙烯醇吡咯烷酮也可與核酸分子形成可逆的中性或陰離子復合體，抑制核酸酶的降解作用[52]。

3.2 改善核酸藥物進入特定組織的能力

在全身性給藥的情況下，進入血液的核酸藥物需要跨越血管內皮屏障才能夠進入目標器官或組織。特別是對神經系統(tǒng)疾病的基因治療而言，要使核酸藥物通過血腦屏障(BBB)進入大腦存在很大挑戰(zhàn)。通過在載體表面修飾特定的靶向分子，如轉鐵蛋白受體的抗體、瘦素等可以幫助其跨越血腦屏障[53]。此外，利用氧化鐵納米顆粒聯(lián)合外部磁場可暫時破壞內皮細胞間連接，激活細胞旁運輸途徑，從而增加血管內皮的通透性[54]。

實體腫瘤組織中的血管系統(tǒng)雖然通透性較強，但藥物必須穿過致密的細胞外基質(ECM)，并克服高間質流體壓力才能到達深部的腫瘤細胞。通過高通透性和滯留效應(EPR效應)富集到實體腫瘤的納米顆粒的最佳尺寸通常為100～200 nm，但要實現向腫瘤內部擴散，這一尺寸卻又過大了。尺寸可動態(tài)改變的納米載體是一種可行的技術，如利用近紅外光觸發(fā)大小可調的脂質體，不僅延長了血液循環(huán)時間，而且脂質體由大(～162 nm)變小(～8.6 nm)后，可促進其向腫瘤深部滲透[55]。此外，有研究表明，帶有正電荷和特定配體修飾的納米藥物可基于細胞轉運實現腫瘤內的穿透，不需要克服ECM的阻礙[56]。

3.3 高效進入細胞

由于核酸藥物必須進入細胞內部才能發(fā)揮作用，因此，穿過細胞膜是其面臨的重大挑戰(zhàn)。吸附性內吞作用、受體介導的內吞作用、巨胞飲作用和吞噬作用是非病毒基因載體被細胞攝取的主要途徑。裸核酸分子的負電性會妨礙其與細胞膜的結合，采用陽離子化載體可以中和核酸分子的負電荷，增強其與細胞膜的結合[29]。一般認為，陽離子載體與細胞膜上的硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)的相互作用會促進核酸復合物的內吞。通過精確調控載體的理化學性質，如表面電位、形狀、尺寸、軟硬度，可以影響細胞對載體的內吞能力[28]；在載體表面修飾細胞特異性配體可顯著增強其在細胞表面的結合[47, 49]。此外，超聲、激光脈沖、電穿孔等物理性輔助技術也可以促進遺傳物質向細胞內傳遞[57]，但目前為止只有少數應用于臨床的報道[58]，低通量、侵入性及操作限制應該是主要原因之一。將微針與電穿孔技術結合的微創(chuàng)電極等研究有助于推動物理性轉染技術的臨床應用[58]。

3.4 溶酶體逃逸及胞內解離和定位

核酸藥物載體主要以內吞方式進入細胞，并最終轉運至溶酶體中。如不能盡快從溶酶體逃逸進入到胞質中，將面臨酸性(pH值約4.5)和各種水解酶的嚴酷環(huán)境，從而被迅速降解失活。內體/溶酶體逃逸始終是提高非病毒載體轉染效率的瓶頸之一。陽離子脂質/DNA復合物可以通過與內體膜融合而從內體中逃逸，其機制可能是陽離子聚合物介導的內體的物理破壞或質子海綿效應[22]；其他常見的策略包括借助光熱、磁熱等物理信號刺激[59]，或利用氯喹、蜂毒肽等輔助性藥物，增加溶酶體的不穩(wěn)定性或誘導溶酶體膜通透化[60]，但需要考慮如何避免溶酶體失穩(wěn)及破裂所帶來的細胞毒性。

進入到胞質中的核酸分子需要及時與載體分離，以發(fā)揮其生物效應。在陽離子脂質/核酸復合物中，帶正電荷的脂質與內體的膜融合有助于核酸分子的釋放，而陽離子聚合物通常被認為更難發(fā)生核酸釋放。通過分子設計在載體中引入還原響應性基團是一種可行的策略，如使用雙硫鍵交聯(lián)的載體。由于雙硫鍵在細胞內的高還原性環(huán)境下(谷胱甘肽的濃度比細胞外環(huán)境中高出約50～1 000倍)會發(fā)生斷裂，有助于核酸分子釋放到胞質中[61]。Nie等借助雙硫鍵的還原響應性制備了在胞內發(fā)生電荷逆轉的Hep@PGEA載體，可自加速釋放編碼CRISPR/Cas9的質粒DNA，用于原位肝細胞癌的治療[62]。與此類似，Fang等利用對ROS/GSH更為敏感的二硒鍵交聯(lián)的精胺長鏈(dPSP)與質粒DNA自組裝成納米顆粒，并同時負載吲哚菁綠(ICG)， ICG能在近紅外光下產生單線氧，促進dPSP中二硒鍵的降解，從而誘導外源基因的有效表達，同時降低細胞毒性[63]。

對于DNA藥物而言，進入細胞核是最后一個重要的限制性步驟，通常只有一小部分DNA能成功進入細胞核。因此，研究DNA核轉位機制以加強這一過程，對提高非病毒基因傳遞效率至關重要。在分裂活躍的細胞中，核膜在有絲分裂過程中解體時會允許DNA進入，但在非分裂細胞中，大尺寸的DNA分子可能需要通過添加核定位序列(NLS)，或在DNA分子上共價修飾NLS多肽等分子，以增強其進入細胞核的能力[64]。為了獲得良好的效果，通常需要多種策略組合。如Tan等開發(fā)了一種核-殼納米平臺用于將基因靶向傳遞到視網膜，其內核由氨基酸功能化的樹狀大分子和核定位信號(NLS)組成，通過靜電相互作用將內核包裹在pH敏感的脂質雙分子層中，并以HA-DOPE為最外層涂層。在該納米平臺的幫助下，DNA可以擴散到視網膜，被細胞內化，從核內體逃逸，最終通過NLS運輸到細胞核[65]。

3.5 蛋白吸附

陽離子型載體的正電荷是一柄雙刃劍，正負電荷的相互作用雖然有利于提高轉染效率，但也導致陽離子型載體容易與各類細胞非特異性結合；同時，帶正電荷的復合體還容易吸附大量蛋白，在表面形成蛋白冠，不僅會導致復合體的電荷及尺寸變化、導致復合體的不穩(wěn)定，還會阻礙遞送載體對靶細胞的識別[66]。通過深入理解血清對陽離子載體轉染的影響規(guī)律，可以有效指導載體系統(tǒng)的設計[67]；此外將陰離子化高分子通過靜電自組裝方式在陽離子型核酸遞送系統(tǒng)外形成負電性外殼，使用蛋白預包被、或直接利用白蛋白等生物蛋白分子作為核酸載體等策略，也可以減少血液中血清成分的影響[68]。

4 總結及展望

盡管非病毒載體介導的核酸轉染能力有了顯著的提高，但與病毒載體相比仍有較大差距，目前在臨床試驗中占主導地位的依舊是病毒載體。隨著新型核酸藥物的開發(fā)和非病毒遞送技術的不斷進步，基因治療及基因-細胞聯(lián)合治療實現大規(guī)模臨床應用的曙光已經開始展現。由于核酸藥物的種類眾多，作用機制各異，分子尺寸千差萬別，期待采用一種“通用性”載體解決所有核酸藥物遞送問題是不現實的。在進入臨床的核酸藥物中，寡聚核苷酸藥物對載體的需求并不強烈，但siRNA分子則高度依賴載體。此外，核酸藥物尺寸是設計遞送載體時必須考慮的另一個關鍵因素，miRNA、siRNA等小核酸藥物可以采用直接偶聯(lián)的簡單劑型，質粒DNA、mRNA等尺寸較大的核酸藥物(通常長度大于200個核苷酸)則更需要載體的壓縮及包裹；小核酸分子在形成穩(wěn)定的復合體時需要載體有較高的正電荷密度，而大尺寸核酸藥物對載體電荷密度的要求較低。由于遞送過程的不同階段對載體的要求有很大差異，智能型、環(huán)境響應性載體將具有更大的優(yōu)勢。未來的核酸治療藥物的設計有很大可能會走向個體化定制的道路，而核酸載體的研發(fā)必然會與之相匹配，標準化、系列化、可床旁調制的核酸遞送載體將是未來發(fā)展的重點。