納米材料組織工程支架在女性生殖系統再生中的應用研究

胡雪純，許海燕

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院，北京 100005)

女性生殖系統(female reproductive system, FRS)包括卵巢、輸卵管、子宮、陰道和外生殖器。FRS相關疾病主要包括生殖系統感染、多囊卵巢綜合征、卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)、 子宮內膜異位癥、盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse, POP)、以及癌癥等，這些疾病對女性的健康和生活質量有重要影響。根據流行病學統計，近年來FRS相關疾病的發病比例正在不斷擴大，并呈現出年輕化的發展趨勢。在這些疾病的治療過程中，可能需要切除部分或全部生殖系統器官，與此同時，術后黏連造成的二次傷害也會導致FRS功能喪失。盡管激素治療、組織冷凍和體外受精技術的發展使很多FRS疾病的相關癥狀得以控制，這些技術并不能使異常組織的結構和功能恢復正常。由于FRS具有復雜的組織結構和生理功能，會隨生理周期和年齡增長而發生較大的變化，因此實現對FRS功能的恢復及器官置換面臨很大的挑戰。近年來，基于納米技術的組織工程支架材料在FRS相關疾病的治療和引導器官再生方面獲得了廣泛的關注。

1 組織工程支架的構建方法

組織工程是應用生命科學和工程學的原理與技術，研究和研發用于修復、維護、促進人體各種組織或器官損傷后修復的功能和形態生物替代物的多學科融合與交叉的學科，其構成要素主要包括種子細胞、生物材料支架、動態培養條件或體內生理環境。選擇合適的種子細胞是構建組織工程復合物最先考慮的問題，目前已有多種干細胞、原代體細胞和細胞系被應用于FRS再生中(表1)。干細胞因其多向分化潛能而成為種子細胞的上游。雖然胚胎干細胞具有發育全能性，但因具有免疫原性和倫理相關問題，而被更多地應用于建立體外模型，研究組織間相互作用。成體干細胞，如骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)、脂肪間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cell, ADSC)和臍帶間充質干細胞，因具有多向分化潛能也被廣泛用于組織工程中。在絕經后女性子宮內膜中仍可獲取具有再生能力的子宮內膜間充質干細胞(endometrial mesenchymal stem cell, eMSC)，來源廣泛且具有免疫調節能力，為FRS組織再生提供了新的選擇[1]。用作種子細胞的體細胞通常是目標器官的構成細胞，與再生器官的結構和功能密切相關。例如，卵泡顆粒細胞(granulosa cell, GC)和卵泡膜細胞(theca cell, TC)不僅能維持卵泡結構正常，還直接構成卵母細胞生長微環境，調控卵泡發育[2]。使用體細胞可以避免干細胞植入后分化形成腫瘤的風險，但是體細胞的再生能力較弱，限制了其使用范圍。此外，從功能異常器官中分離得到的體細胞是否仍具有正常生理功能也需要考慮。有研究通過對POP患者癥狀分級，并結合是否絕經、激素水平等客觀指標對人陰道成纖維細胞(human vaginal fibroblast, HVF)的功能進行評估，判斷其是否適用于自體移植[3]。針對這一問題，異位功能正常的細胞也常被用作種子細胞，如使用口腔黏膜成纖維細胞和上皮細胞分別代替陰道成纖維細胞和子宮內膜上皮細胞作為種子細胞[4-5]。

用于FRS再生的材料主要包括脫細胞支架材料以及多種天然材料和合成材料，例如膠原蛋白、透明質酸、聚氨酯、聚乙二醇及其衍生物等。選擇合適的生物材料是成功進行FRS再生的先決條件[26]。理想的生物材料應具有良好的生物相容性、仿生微結構和與靶組織匹配的機械性能[27]。植入材料的微觀結構通過影響再生部位的拓撲結構而引導組織再生。脫細胞化細胞外基質(decellularized extracellular matrix, dECM, 簡稱脫細胞基質)來源于細胞分泌的細胞外基質，具有良好的生物相容性和三維結構。不同的制備方法會影響dECM的構成，從而影響細胞對材料的響應過程和材料植入后引導組織再生的速度[28]。Miki等將具有完整子宮內膜-肌層-外膜結構的dECM材料，按照與天然組織結構同向(即dECM內膜面朝內)或反向(即內膜面朝外)植入子宮缺損部位，結果表明，反向植入dECM的再生組織中出現腺體異位、平滑肌層異常的現象顯著高于同向植入組[29]。Mukherjee等利用靜電紡絲技術制備與陰道微結構類似的微孔支架，可以對陰道結締組織進行有效重塑[30]。合適的機械性能也是理想的生物材料所應具備的條件之一。植入與組織機械性能不匹配的材料，會導致植入部位組織糜爛、局部感染等不良反應。聚苯胺(polypropylene, PPL)材料早期被用于陰道薄弱組織的重建，但由于機械性能遠強于周圍組織，植入后常導致陰道感染和慢性鈍痛，同時在PPL支架周圍常形成瘢痕組織[31]。機械性能較差的生物材料則需通過改變材料交聯方式，或與多種材料進行混合等方法進行優化[32]。

表1 用于女性生殖系統再生的種子細胞Table 1 Seed cells for female reproductive system regeneration

2 組織工程技術在女性生殖系統組織再生中的應用研究

2.1 卵巢早衰

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是一種常見的內分泌疾病，可導致不孕不育以及潮熱、骨質疏松等并發癥。POF的治療方法主要為激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT)，使用雌激素單獨或與黃體酮聯合進行治療。HRT雖然可以緩解POF的一些癥狀，但它只是體外補充卵巢分泌的激素，并不能使卵巢組織自身分泌激素的功能恢復正常，還可能增加患乳腺癌和心血管疾病的風險。

有研究組使用生物材料來封裝細胞，并構建成組織工程支架，以模擬卵巢組織，再利用細胞分泌的分子混合物對POF進行治療。例如，Sittadjody等使用多聚鳥氨酸制備多室細胞微球以模仿卵泡的組織結構。先將卵泡顆粒細胞(GC)包裹在芯層，再將卵泡膜細胞(TC)包裹在殼層，細胞微球產生的雌性激素可以調節下丘腦-垂體-卵巢軸，但其分泌的雌激素含量遠低于正常水平且難以持續[15]。芳香化酶是體內合成雌激素的限速酶，通過向上述細胞微球中引入分泌芳香化酶的BMSC，可以提高細胞微球分泌雌激素的能力[6]。Yoon等利用擬胚體形成培養板和基質膠制備了由內向外依次為GC-基質膠-TC的細胞微球，并用明膠和聚(N-異丙基丙烯酰胺)納米纖維制備血管化水凝膠，用以搭載細胞微球，并將其植入到卵巢切除大鼠的缺血后肢中。結果表明，從水凝膠釋放的雌性激素可以幫助大鼠的內分泌功能恢復正常，同時該方法未出現HRT治療的不良反應[33]。此外，也有研究人員利用生物材料的黏附作用，使用生物材料搭載干細胞原位注射在卵巢組織中，通過引導卵巢組織再生治療POF[7]。

2.2 卵泡體外培養

卵子冷凍技術的發展為保存女性生育能力提供了可能，但這一技術并不適用于有排卵障礙、需接受抗腫瘤治療和不能接受激素刺激的女性。卵泡由卵母細胞、顆粒細胞(GC)和膜細胞(TC)構成，是卵巢的基本功能單位。由于卵泡結構是卵母細胞成熟的必需結構，同時卵巢內含有大量的初級卵泡，因此，發展卵泡體外成熟方法對于生育能力的保存十分重要。卵泡的生長和成熟是一個復雜的過程，在早期需要卵巢微環境、旁分泌和自分泌的交叉調控，后期還需要受下丘腦-垂體-卵巢軸分泌的促性腺激素的調控。在卵泡成熟過程中，卵泡體積會增大600倍左右，同時卵泡周圍組織空間結構會發生變化。因此制造可以促進卵泡成熟的人工環境仍具有較大挑戰。

使用生物材料包封卵泡可以對卵泡進行體外培養，同時提高經冷凍、解凍和再移植后存活卵泡的數量與活力[34-35]。Shikanov等設計制備了具有分子內自交聯、膜敏感多肽交聯、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)敏感多肽交聯鍵的多臂聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)水凝膠，用于卵泡的體外培養。在生長發育過程中，卵泡通過降解水凝膠中的多肽交聯位點導致水凝膠發生局部降解，既為卵泡的成熟提供空間，還可以避免水凝膠的整體塌陷[36]。冷凍干燥的海藻酸鈉水凝膠具有直徑為80～100 μm且貫通性良好的微孔結構，被廣泛用于卵泡的體外培養。骨形態發生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4, BMP-4)能促進原始卵泡向初級卵泡轉變，并促進初級卵泡的生長。Felder等模擬BMP-4與硫酸乙酰肝素的自然結合，制備了可以與BMP-4結合的海藻酸鈉硫酸酯水凝膠，使用該水凝膠包載卵巢基質細胞和卵泡[37]。在體外共培養21天后，將卵泡水凝膠復合物移植進卵巢切除小鼠體內，結果顯示，卵泡功能正常且小鼠血清和陰道中雌激素水平顯著升高。Healy等使用柔軟的明膠包裹GC作為內層，以較硬的海藻酸鈉包裹TC作為外層，結合微流控技術構建了人工卵泡結構。該人工卵泡具有相對完整的內分泌功能，可以培養從初級卵泡中分離出的卵母細胞，并維持卵母細胞的大小和細胞間隔[38]。

2.3 子宮宮腔黏連

宮腔黏連(intrauterine adhesions, IUA)是由于破壞性刮宮或反復的子宮內膜炎導致子宮內膜被破壞的疾病。IUA是繼發性不孕的主要因素之一，目前主要治療方法是通過物理方法對黏連部位進行分離和阻隔防止再次黏連，但是難以進一步促進損傷子宮內膜進行修復。Cai等制備了載有堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的液滴微流控多孔支架治療IUA[39]。該支架具有良好的可壓縮性，可通過宮頸遞送進子宮內，具有良好的抗粘附作用。通過微流控技術制備的支架具有更高的載藥量，支架搭載的bFGF可以促進子宮內膜損傷部位的組織修復。利用搭載干細胞的組織工程復合物對子宮內膜進行修復，正在發展成為IUA治療的新策略。聚葵二酸甘油酯(poly(glycerol sebacate), PGS)具有與子宮組織相似的機械性能。PGS搭載BMSC不僅可以延長BMSC在子宮損傷部位的滯留時間，還可以為BMSC向子宮內膜基質細胞(endometrial stromal cell, ESC)方向分化提供適宜的微環境[40]。干細胞組織工程復合物雖然可以有效治療IUA，但面臨著植入率低、腫瘤形成、儲存和運輸不便的限制。干細胞的分泌物包括多種細胞因子和趨化因子，在組織再生中有重要的作用。與注射活細胞相比，使用干細胞的分泌物安全性更高。在體外實驗中，干細胞分泌物具有促進子宮內膜細胞生長的作用。Liu等使用改性透明質酸水凝膠包載干細胞分泌物，并將水凝膠經宮頸遞送進子宮，可顯著提高子宮內膜厚度、子宮腺數量和小鼠懷孕率[41]。

2.4 子宮缺損修復

子宮壁由內向外可分為子宮內膜、肌層和子宮外膜，子宮壁結構缺損會嚴重影響女性的生育能力，而子宮移植技術需要考慮供體器官短缺和免疫排異反應等問題。組織工程在子宮缺損修復方面顯示出了應用潛力。例如，Li等在膠原蛋白上分別連接血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和bFGF，制備具有改善子宮內膜和平滑肌再生能力、促進血管重建的支架材料修復缺損子宮[42-43]。Cai等則用絲素蛋白-細菌纖維素多孔材料包載外源性基質細胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1α, SDF-1α，也稱為CXCL12)，通過激活CXCR4/CXCL12信號通路招募內源性細胞向損傷部位遷移，尤其是干細胞，實現對子宮缺損的修復[44]。但是以上研究均在面積較小的缺陷上進行，遠未達到臨床子宮缺損和子宮移植所需的面積。在嚙齒類動物模型中，使用無細胞的生物材料支架可以較好地誘導0.5 cm以內的缺損組織再生。若缺損尺度超過該范圍，成纖維細胞的遷移會占主導，導致材料上膠原過度沉積并形成瘢痕組織[45]。Magalhaes等使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)涂覆的聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)微孔支架搭載原代子宮組織細胞，對接近全缺損的兔子子宮進行修復，研究結果表明，負載細胞的組織工程復合物形成了包括子宮內膜上皮腺、上皮腔和基質層的兩層血管化內膜組織，與子宮組織結構相似[46]。

2.5 盆腔器官脫垂

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse, POP)是由于女性盆腔器官下降導致陰道或子宮突出而引起的器官功能異常疾病。雖然POP引起的致死率極低，但常造成排便異常、壓力性尿失禁、盆腔慢性鈍痛、性生活障礙等并發癥，嚴重影響女性的日?；顒雍蜕钯|量。盡管POP致病因素個體化差異較大，但共性特征是患者盆底結締組織的機械強度顯著降低。POP患者HVF膠原蛋白合成減少，細胞外MMP-2、MMP-9表達增強，加速膠原降解，細胞凋亡相關蛋白表達增強，導致盆底結締組織結構松弛。

異物反應較低且與天然細胞外基質(extracellular matrix, ECM)結構相近的組織工程復合物有望促進組織整合與再生。Qin等在甲基丙烯酰明膠(methacrylate gelatin, GelMA)中添加具有抗炎活性和抑制MMP-2、MMP-9活性的天然產物葛根素來引導盆底結締組織再生[25]。含葛根素的GelMA材料不僅可以減緩結締組織中ECM的降解速度，還可以降低材料中光敏劑的細胞毒性。海藻酸鈉是生物3D打印中最常用的材料之一，Paul等通過混合蘆薈水凝膠降低海藻酸鈉的用量，并包載eMSC進行生物3D打印制備納米支架。利用蘆薈膠的抗菌和抗氧化活性以及eMSC的免疫調節功能，減少材料周圍炎性細胞的滲透并降低促炎型巨噬細胞比例，減輕材料植入后的異物反應[47]。Mori da Cunha等構建了聚碳酸酯超分子聚合物，并使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽(arginine-glycine-aspartic acid, RGD)對超分子進行修飾，用該材料制備的納米纖維支架對巨噬細胞具有免疫調節功能，還可以促進新生血管和結締組織向支架內生長[48]。雌二醇作為一種MMP抑制劑不僅可以促進盆底結締組織中ECM的增加，還可以通過雌激素受體刺激血管內皮細胞形成新生血管，有研究團隊使用混有雌二醇的聚氨酯靜電紡絲薄膜搭載ADSC治療POP，含有雌二醇的紡絲薄膜抗張強度增強，與盆底結締組織更吻合[49]。

3 問題與展望

基于納米材料的組織工程技術為FRS相關疾病的治療提供了一種新的策略。近年來關于組織工程在FRS方面的應用研究日益增多，但距離臨床應用仍有較遠的路程。受FRS功能特殊性影響，用于FRS再生的材料以dECM和天然材料為主。這類材料雖然具有較好的生物安全性，但其制備過程中的標準化和可重復性較低，而且異種來源的dECM材料還面臨著免疫排異的風險。此外，已有的研究主要使用嚙齒類動物對所構建的組織工程復合物功能進行評價，但是嚙齒類動物的FRS在結構和尺寸上與人類相差較遠。另一個方面，種子細胞獲取途徑和倫理問題也給開展研究帶來一定的局限性。當前也有大量研究使用人類來源的細胞，通過構建組織工程復合物，對FRS進行體外建模和分析，研究FRS的動態生理環境、生殖相關生理過程、子宮內膜異位癥等疾病的發病機制，但體外模型與真實組織器官的差距需要進一步縮小。開發安全的仿生生物材料以代替天然組織結構，同時選擇可平衡再生能力、功能化和安全性的種子細胞及適宜的動態培養條件是實現FRS相關器官再生和重構的關鍵要素，在此方面取得的突破將為女性生殖能力恢復與保存提供新方法。