微貯干玉米秸稈和廢棄物單相厭氧共消化產沼氣能力分析

楊旭,孟祥玉,宋麗麗,張志平,馬歌麗,魏濤*

1(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450002) 2(鄭州市代謝工程和系統生物學重點實驗室,河南 鄭州,450002)

農業廢棄物屬于木質纖維原料(lignocellulosic biomass,LCB),水解過程是厭氧消化(anaerobic digesters,AD)的限速步驟[1]。為此,大多數工藝通過兩相AD提高沼氣生產效率[2]。然而,WU等[3]發現底物水解易受高濃度酸化產物的抑制。LI等[4]和DALKILIC等[5]也報道了類似的結果：過量有機酸不僅反饋抑制酸化相中有機酸和氨氮,而且還會破壞產甲烷相的最適條件。因此,有必要對兩相AD工藝進行優化以提高原料適應性和工程穩定性操作。在酸化過程中適當通風可以顯著提高木質纖維素的降解效率,增加有機酸的產生,同時加速底物分解,提高產沼氣效率,并且還可減少有毒氣體,如H2S和NH3的產生[6-7]。為了提高降解效率,通常通過物理、化學或者生物強化方法對原料進行預處理,以提高沼氣產率[8]。然而,苛刻的預處理條件和化學試劑的使用導致機械能耗和投資成本的增加,而且復雜的處理過程限制了項目的進一步應用。近年來,農業廢棄物特別是干秸稈的微貯預處理技術已成為研究的熱點,其基本原理是在厭氧條件下利用乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)生物轉化可溶性碳水化合物產生大量有機酸,降低原料pH值,殺死或抑制其他有害細菌,可達到長期保存和預處理的目的[9]。干秸稈原料經過微貯處理后,干物質損失可低至1%～5%,可生化降解性能得到提高[10],主要是因為非結構碳水化合物的降解降低了LCB的生物抗性[11]。微貯處理可以解決秸稈大規模收集、保存和預處理的問題,與傳統物理和化學方法相比,該技術不需要消耗大量能量和回收化學試劑,也不會在反應體系中產生抑制劑。由于在微貯預處理過程中產生大量有機酸,微貯處理過程可以取代兩相AD的酸化過程,從而實現單相AD。

在AD過程中,原料的特性決定了AD時間和沼氣產量[12]。例如,單一LCB的AD存在碳氮不平衡的問題,由于LCB的C/N比接近70∶1,而AD的最佳C/N比為(20∶1)～(30∶1)[13]；由于豬糞原料C/N比低,AD過程中容易產生氨氮抑制,使得難以達到AD微生物群所需的最佳生長狀態[14]；剩余污泥(excess sludge,ES)的AD過程水解預處理是一個限制步驟,ES細胞壁結構抑制細胞內可降解物質的水解,常規污泥消化通常需要較長的停留時間[15]。為解決上述問題,越來越多的AD過程采用多種原料復配進行厭氧共消化,不僅可以有效調節單一原料的營養不平衡問題,還可以提高沼氣轉化效率[16]。

本文以干玉米秸稈(dry corn stover,DCS)為研究對象,深入研究了不同微生物厭氧預處理DCS過程中微生物的動態變化及DCS成分改變情況。在此基礎上,比較分析了DCS兩相AD(微好氧酸化+厭氧消化)與微貯DCS單相AD沼氣產量的差異。最后,研究了微貯DCS和廢棄物(豬糞或ES)單相厭氧共消化沼氣發酵效率,以探索農業廢棄物資源利用的高效途徑。

1 材料與方法

1.1 原料

DCS由河南天冠企業集團有限公司提供,成分分析結果為：總固形物(total solid,TS)：87.52%；揮發性固體(volatile solid,VS)：82.19%；纖維素[以葡聚糖(glucan)含量計]：33.82%；半纖維素[以木聚糖(xylan)含量計]：24.99%；總氮(total nitrogen,TN)：0.94%；灰分：2.24%。實驗中用到的微生物：糞鏈球菌、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌等由本實驗室保藏。

ES由鄭州市五龍口污水處理廠提供(TS：32.51%；VS：15.51%；纖維素：2.80%；半纖維素：2.07%；TN：4.16%；灰分：17.00%),實驗室冷凍保存,使用前在85 ℃水浴條件下保溫1 h后加入發酵裝置中進行厭氧消化。

豬糞(pig manure,PM)：由南陽市臥龍牧原養殖有限公司提供(TS：31.02%；VS：19.53%；纖維素：11.93%；半纖維素：12.42%；TN：1.90%；灰分：11.49%),實驗室冷凍保存,使用前在85 ℃水浴條件下保溫1 h后加入發酵裝置中進行厭氧消化。

1.2 實驗方法

1.2.1 干玉米秸稈微貯

微貯容器采用玻璃壇子。微貯過程如圖1所示,活化種子液倒入1.5 kg DCS中裝入壇子,控制最終含水量為30%。微貯實驗分3組：芽孢桿菌組DCS-S1(枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶納豆芽孢桿菌=1∶1∶1)、混合組DCS-S2(糞鏈球菌∶發酵乳桿菌∶干酪乳桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶納豆芽孢桿菌=1∶1∶1∶1∶1∶1)和乳酸菌組DCS-S3(糞鏈球菌∶發酵乳桿菌∶干酪乳桿菌=1∶1∶1),每個微生物的接種量為1.0×106個/g DCS。裝填完畢后蓋上玻璃碗,在壇子頂部加入適量水密封達到厭氧發酵的目的。發酵時間為28 d,每隔7 d取樣進行分析測定。

圖1 干玉米秸稈微貯過程及取樣時間點設置Fig.1 The production diagram of silage used in this study with the sampling points indicated

1.2.2 厭氧消化

本研究共設置2種AD工藝(圖2-a和2-b)：兩相(微好氧酸化相+甲烷相)AD和單相AD。

兩相AD酸化相(圖2-a)：本實驗采用自制微好氧水解酸化裝置(酸化罐采用密閉裝置,過程中通入空氣,采用溶氧電極監控以維持反應體系溶氧濃度接近1 mg/L),反應器有效容器為5 L。實驗原料為DCS,酸化相固形物濃度為8% TS,采用AD罐放出的過濾沼液配料。每天間歇機械攪拌(50 r/min 開啟20 min,關閉20 min,循環)使反應體系混合均勻。酸化相溫度為(35±2)℃,周期為2 d(每一批次加料120 g絕干原料)。酸化結束后,取出酸化液總量80%加入AD罐發酵沼氣,余下20%作為下一批次酸化接種物。

a-兩相AD;b-單相AD圖2 兩相AD和單相AD工藝流程圖Fig.2 Process flow charts of two-phase AD and single-phase AD

兩相AD甲烷相(圖2-a)：本實驗厭氧消化反應器為實驗室自制反應裝置,反應器體積為100 L,反應器內溫度為(45±2)℃,整個消化試驗采用半連續方式。每隔2 d加入酸化液,放出等量沼液,采用100目篩網過濾后液體用于酸化配料(沼渣烘干)。每日通過空氣流量計讀數記錄沼氣產量,并定時取樣進行CH4含量分析。

單相AD(圖2-b)：本實驗厭氧消化反應器為實驗室自制反應裝置,反應器體積為100 L,反應器內溫度為(45±2)℃,整個消化試驗采用半連續方式。每隔2 d加入微貯DCS[或微貯DCS+ES/PM混合物進行厭氧共消化,每一批次加料120 g絕干物料。其中,微貯DCS∶ES=6∶1(絕干質量比)；微貯DCS∶PM=4∶1(絕干質量比),以平衡混合原料C/N],提前放出等量沼液,采用100目篩網過濾后液體用于配料(沼渣烘干),固形物濃度為8% TS。每日通過空氣流量計讀數記錄沼氣產量,并定時取樣進行CH4含量分析。

1.3 分析方法

1.3.1 DNA提取、基因測序及序列分析

DNA具體提取過程參照OMEGA試劑盒Soil DNA Kit的使用說明書。通過Qubit3.0熒光計監測DNA濃度。文庫制備和上機測序委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3.2 常規指標測定及分析方法

干物質的測定采用105 ℃烘干3 h至恒重,差重法測定；TS的測定采用105 ℃烘干24 h,差重法測定；VS的測定采用550 ℃灼燒4 h,差重法測定；TN采用微量凱氏定氮法測定；纖維素和半纖維素采用美國國家重點實驗室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)提供的標準方法測定；將原料與水料液比1∶10(g∶mL)于100 r/min 振蕩30 min,濾液用于pH 值、有機酸和游離糖含量測定；有機酸和游離糖含量采用高效液相色譜儀(Agilent technologies 1260 Infinity)分析檢測；CH4和CO2含量采用氣相色譜儀分析檢測(GC7980)[12]。

TS產氣率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m,原料質量,g；w(TS),預處理原料的總固體質量分數,%；V,累積產氣量,mL。

2 結果與分析

2.1 微貯干玉米秸稈成分分析

微貯樣品的pH值、發酵時間和乳酸含量可作為微貯是否成功的重要指標[17]。由于發酵過程中乳酸和乙酸的產生,微貯樣品pH值呈現逐漸降低的趨勢(圖3-a),特別是DCS-S2在發酵28 d后pH值為4.08,可抑制發酵過程不良微生物的代謝活動[18]。微貯樣品中游離葡萄糖含量較低,說明在厭氧發酵過程中游離葡萄糖被微生物代謝產生乙酸和乳酸等有機酸類物質[19]。

a-pH值；b-乳酸濃度；c-乙酸濃度；d-木糖濃度圖3 DCS微貯過程物化性質分析Fig.3 Physicochemical changes in DCS samples

芽孢桿菌發酵組DCS-S1樣品中乙酸含量高,乳酸發酵組DCS-S3樣品中乳酸含量高(圖3-b、圖3-c)。發酵28 d后,DCS-S3中乳酸和乙酸的含量分別為3.60%和0.45%。DCS微貯過程中木糖含量的提高(圖3-d)表明原料半纖維素發生了降解。據報道,半纖維素水解可提高木質纖維素生化降解效率[20],因此,微貯可作為一種潛在的纖維原料預處理方法。對DCS進行微貯預處理,需要28 d才能達到穩定,因此本文采用微貯28 d的樣品進行后續AD實驗。

目前,由于季節性因素,生物質工廠收集到秸稈的存儲方式一般為干儲存。在干儲存過程中要綜合考慮降雨量、平均主導風向等氣象因素,不過室外儲存過程干物質損失大,需要較大的場地堆放秸稈,秸稈容易霉變和起火[21]。因此采用溫和條件下的生物預處理方式(微貯)是十分必要的。由表1可知,微貯對結構性碳水化合物纖維素(以葡聚糖計)含量影響較小,說明微貯過程可以有效保存DCS。半纖維素(以木聚糖計)和木質素(酸溶木質素和酸不溶木質素)有適量降解,可能是物料可消化性高于干儲存的主要原因[22],對原料后續生化轉化也能起到一定的預處理作用[23]。

表1 DCS微貯前后主要成分變化情況Table 1 Compositions of DCS and DCS silage of DM

2.2 微貯干玉米秸稈細菌群落結構分析

就相對豐度而言,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是所有樣品中主要門類(圖4)。特別是DCS-S1樣品中,變形菌門最豐富,相對豐度達到89.37%。厚壁菌門在DCS樣品中的含量(0.14%)遠低于樣品DCS-S3(32.71%)。相比之下,DCS中擬桿菌門相對豐度(12.53%)比DCS-S2(1.99%)高。

圖4 DCS微貯前后原料細菌門水平相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial composition in DCS samples at phylum level

在屬水平上(圖5),泛菌屬(Pantoea)是所有樣品中最豐富的分類屬,占19.16%～23.21%。DCS-S3中優勢微生物鑒定為腸球菌屬(Enterococcus),其相對豐度為35.47%,而在DCS中相對豐度僅為0.14%,表明接種的LAB可促進腸球菌的增殖。在微貯過程中,腸球菌能降低原料pH值并增加乳酸的量,特別是在發酵早期[24]。在低pH值,特別是4.00以下,可避免腐敗微生物的繁殖代謝,微貯過程接近停止。香農多樣性指數(Shannon index)結果表明,細菌群落的多樣性從DCS的3.787提高到DCS-S1的3.983,但DCS-S2(3.670)和DCS-S3(3.368)的細菌多樣性下降,主要是由于發酵后期LAB成為優勢菌群,抑制了其他細菌的生長繁殖。乳桿菌屬在DCS中為0.00%,但在DCS-S2中顯著增加至14.76%,高于DCS-S3中的7.66%。因此,通過添加混合LAB和芽孢桿菌比單獨添加LAB可以更多地增加乳酸桿菌數量。寡養單胞菌(Stenotrophomonas)(17.34%)和鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium)(11.61%)是DCS的主要屬,但它們在微貯樣品中變得不那么豐富。在DCS中未檢測到芽孢桿菌,雖然在DCS-S1和DCS-S2中有所添加,但微貯DCS-S1中芽孢桿菌的豐度較低(0.02%)。

圖5 DCS微貯前后原料細菌組成屬水平相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacterial composition in DCS samples at genus level

基于細菌OTU相對豐度的相似性分析結果表明(圖6)：所有樣品可以分成2類,一類由DCS和DCS-S1樣本組成。一類由DCS-S2和DCS-S3樣本組成。這種分類與微貯接種物是否添加LAB一致。因此,微貯通常依靠微生物(主要是LAB)將生物質中的可溶性碳水化合物(water soluable carbohydrate,WSC)轉化為有機酸(圖3-b)[25]。有機酸的產生將原料的pH值降低到4.00以下(圖3-a),抑制了其他微生物的生長,從而有效保存生物質[26]。

圖6 基于DCS微貯前后原料細菌OTUs相對豐度 的相似性分析Fig.6 Analysis of similarity among DCS samples fermented by microorganism based on the relative abundance of bacterial OTUs

2.3 厭氧消化

本實驗以DCS和微貯DCS-S3(28 d)為原料,比較不同AD工藝對DCS微貯前后的沼氣產量的影響,并考察微貯DCS-S3和ES/PM混合厭氧共消化對發酵沼氣的提高作用。由圖7結果可知,DCS經過微貯后產生適量有機酸(特別是乳酸和乙酸)作為甲烷的前體物質,可以取代兩相AD的酸化過程,原料每天產氣率有了一定程度地提高；微貯DCS和廢棄物(ES/PM)厭氧共消化可有效緩解單一原料AD過程C/N不平衡問題,有效提高沼氣產率。

圖7 原料產氣率統計Fig.7 Statistics of dairy biogas yield with materials

由圖8結果可知,采用兩相AD對DCS進行沼氣發酵,原料累積產氣量為292.06 mL/g TS,可超過傳統玉米秸稈完全混合式厭氧反應器沼氣發酵水平[27]。這應該是微好氧酸化過程中通氣有利于木質纖維素成分的快速降解。有報道指出水解酸化細菌在通氣條件下可大量分泌纖維素酶,而在厭氧環境中,水解細菌產酶能力下降,且易受到反饋抑制的影響,分解率降低[28-29]。DCS微貯預處理可以取代兩相厭氧消化過程中的酸化過程,并對DCS起到一定的預處理作用。微貯DCS單相AD結果表明原料累積產氣量可達到411.46 mL/g TS,較DCS兩相AD提高了40.88%。

圖8 原料累積沼氣產量統計Fig.8 Statistics of cumulative biogas yield with materials

提高反應器性能和穩定性的一種策略是多底物厭氧共消化[30]。本文將微貯DCS和ES/PM按照一定比例混合進行單相厭氧共消化,累積沼氣產量分別達到500.97和599.39 mL/g TS(圖8),較單一原料AD有明顯提高。因此,有機廢棄物(含氮量高)和LCB(含碳量高)共同厭氧共消化是平衡底物成分的有利策略。重要的是,2種容易獲得的低成本原料含有互補的C和N含量,使其成為AD和可再生能源生產的理想底物[31]。將DCS、ES和PM混合厭氧共消化可以突破歐盟國家用帶穗玉米秸稈青貯作為主要原料的局限,使用干秸稈和各種有機廢棄物,適合中國國情,對徹底解決焚燒秸稈、剩余污泥填埋以及畜禽糞便面源污染問題有重要意義。

3 結論

通過對DCS進行微貯預處理,考察了不同接種微生物組合對原料的主要成分影響及微貯樣品的細菌多樣性分析,比較了DCS兩相AD及微貯DCS單相AD在沼氣產量上的差異,探討了微貯DCS和ES/PM混合厭氧共消化對沼氣產率的提高作用,得出如下主要結論：

(1)微貯可以作為秸稈沼氣發酵的有效預處理方式之一。不同微生物組都能達到相應的微貯效果,只是原料中的代謝產物(如乳酸、乙酸等)含量不同,不過LAB是較適合接種物,有利于產生有機酸,降低體系pH值；

(2)DCS經過微貯后產生適量有機酸(特別是乳酸和乙酸)作為甲烷的前體物質,可以取代兩相AD的酸化過程,加快AD速度。另外,適量有機酸有利于維持AD體系緩沖能力(本實驗裝置運行2年來反應體系pH值一直維持在7.2～7.5之間)；

(3)微貯DCS和廢棄物(ES/PM)厭氧共消化可有效緩解單一原料AD過程C/N不平衡問題,有效提高沼氣產率。