一株高產己酸乙酯酵母菌株的篩選、鑒定及發酵條件優化

秦立芹,殷歡,成柳潔,龔藝,丁澤,李秀婷,2,3,范光森,2,3*

1(北京工商大學 食品與健康學院,北京,100048) 2(北京市食品添加劑工程技術研究中心(北京工商大學),北京,100048) 3(北京食品營養與人類健康高精尖創新中心(北京工商大學),北京,100048)

白酒是我國國酒,因風味特征差異而分為不同香型,其中具有獨特風格的濃香型白酒深受消費者的喜愛,其飲用量和銷售量在眾多香型白酒中獨占鰲頭[1]。在影響濃香型白酒獨特風格的眾多風味物質中,具有甜香、水果香、窖香和青瓜香的己酸乙酯是濃香型白酒的主要特征風味物質,其含量的高低直接決定了濃香型白酒的品質[2-3]。然而,對濃香型白酒品質如此重要的風味物質,在傳統釀造發酵過程中,含量卻往往達不到高品質濃香型白酒的要求,造成濃香型白酒優質品率低；另外,白酒生產過程中豐富度較高的乳酸菌會產生過多的乳酸,從而生成過量的乳酸乙酯,造成乳酸乙酯和己酸乙酯比例的嚴重失調,加劇了濃香型白酒品質的下降[4]。因此,在濃香型白酒釀造過程中,如何提高己酸乙酯含量是穩定和提高濃香型白酒品質需解決的首要問題。

產香酵母是一類能夠代謝生成酯類化合物的非釀酒酵母菌的總稱,又稱生香酵母,該類酵母能夠利用葡萄糖等糖源代謝產生乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯等,在白酒釀造過程中起到非常重要的提酯增香作用[3]。將扣囊覆膜酵母和釀酒酵母共強化應用于小曲白酒釀造生產中,相比對照組,乙醇和酯的含量都有明顯的提高,增強了酒體風味[5]；將產香酵母長孢洛德酵母Z9Y-91強化于復糟酒生產中,相比對照組,乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸異戊酯等風味酯含量上升,復糟酒感官指標得到提高[6]；應用2株不同異常威克漢姆酵母對白酒固態模擬進行強化研究,結果表明2株酵母都不同程度的提高了酒糟中的風味酯含量[7]。由此可見,產香酵母是白酒釀造中品質提升的重要功能菌株。在眾多產香酵母合成酯類相關研究中,有關高產乙酸乙酯的研究較多,而有關白酒4大酯(乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯)中其他3種酯的研究較少。鑒于己酸乙酯對濃香型白酒的重要性,篩選分離獲得高產己酸乙酯的產香酵母不失為提高濃香型白酒釀造中己酸乙酯含量的有效途徑之一,研究和選育高產己酸乙酯產香酵母菌株具有重要的現實意義。為此,本文采用傳統篩選方法獲取高產己酸乙酯的酵母菌株,并對其進行鑒定和發酵條件優化,為提高濃香型白酒品質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大曲,瀘州老窖股份有限公司、山東扳倒井股份有限公司、安徽古井貢酒股份有限公司、河北衡水老白干酒業股份有限公司等。

酵母基因組DNA提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；己酸乙酯,Sigma公司；色譜級純正庚烷,麥克林公司；耐高溫淀粉酶、糖化酶,上海源葉生物科技有限公司；高粱,產自山東臨沂地區；其他試劑均為國產生物或分析純試劑。

YPD液體培養基(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,自然pH,121 ℃條件下滅菌20 min；YPD固體培養基為在液體培養基基礎上添加20 g/L的瓊脂粉。

高粱酶解液參考FAN等[3]的方法：250 g高粱粉碎后,加入1 L蒸餾水,糊化后,利用耐高溫淀粉酶(200 μL)于90 ℃下液化1 h,冷卻至60 ℃,加入糖化酶(0.125 g)糖化2 h。隨后,趁熱過濾,并室溫離心10 min,離心轉速為10 000 r/min,上清液糖度調至8 °Brix后分裝于三角瓶中(30 mL/250 mL),115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器和設備

YQX-SG46-280S高壓蒸汽滅菌器,上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DL-CJ-2 ND I型生物潔凈工作臺,北京東聯哈爾儀器制造有限公司；BL-2200H電子天平,島津國際貿易(上海)有限公司；PHS-3C型 pH計,上海精密科學儀器有限公司；TENSUC恒溫搖床,上海天呈實驗儀器制造有限公司；LHS-100CL恒溫恒濕培養箱,上海一恒科學儀器有限公司；TU-19紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；CKX41-F32FL倒置熒光顯微鏡,日本OLYMPUS公司；Microfuge 2R離心機,北京田林恒泰科技有限公司；Tprofessional型 PCR儀,Biometra公司；TSQTM8000 evo三重四級桿氣質聯用儀,美國Thermo Fisher Scientific。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌株的篩選和分離

酵母菌株的篩選和分離方法參照FAN等[3]的方法,將逐級稀釋的不同濃度的大曲菌懸液,涂布于YPD固體培養基平板上,28 ℃倒置培養,挑取疑似酵母菌落進行劃線分離后采用顯微鏡觀察和確定。

1.3.2 高產己酸乙酯酵母菌株的篩選

將上述篩選得到的酵母分別接種于YPD液體培養基中活化24 h,以0.3%(體積分數)的接種量接入高粱酶解液培養基中,于28 ℃,180 r/min培養24 h(第1階段-細胞積累階段),然后加入4%(體積分數)的無水乙醇和0.04%(體積分數)的正己酸,繼續發酵36 h(第2階段-合成己酸乙酯階段),發酵液于室溫下離心(10 000 r/min,10 min),獲得的上清液進行己酸乙酯含量的測定,測定方法采用GC-MS方法。

1.3.3 菌株Y9鑒定

采用菌落形態、顯微鏡觀察、生理生化結合分子生物學技術對篩選獲得的高產己酸乙酯酵母Y9進行鑒定,具體方法參照FAN等[3]的方法。

1.3.4 菌株Y9生物學特性

參照文獻[3]的方法考察酵母Y9的最適生長溫度和生長溫度耐受性(20、25、30、35、40、45、50 ℃)、最適生長pH和生長pH耐受性(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)、葡萄糖耐受性(100、200、300、400、500、600、700、800、900 g/L)、NaCl耐受性(0、50、100、150、200、250、300 g/L)、己酸耐受性(體積分數0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%)、乙醇耐受性(體積分數0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%)和己酸乙酯耐受性(0、300、600、900、1 200、1 500和1 800 mg/L)。

1.3.5 菌株合成己酸乙酯條件優化

將酵母Y9接種于YPD液體培養基中于28 ℃活化培養24 h,按照0.3%(體積分數)接種量接種于高粱酶解液培養基中,28 ℃,180 r/min培養24 h,完成第1階段細胞的積累,然后加入4%乙醇和0.04%(體積分數)己酸,繼續培養,完成第2階段己酸乙酯的合成。采用單因素考察培養基條件(糖度和pH)及其第2階段發酵條件(溫度、轉速、接種量、乙醇添加量、己酸添加量、前體添加時機和發酵時間)對酵母合成己酸乙酯的影響。

1.3.6 己酸乙酯含量測定

發酵液中己酸乙酯含量采用GC-MS進行檢測。發酵液離心后取3 mL加入到裝有3 mL正庚烷的試管中,充分混勻后靜置萃取2 min,取有機相部分于5 mL離心管中,加入適量無水硫酸鈉除去痕量水,用有機濾膜過濾后采用GC-MS測定己酸乙酯含量,毛細管色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；分流比37:1；采用程序升溫(50 ℃,保留2 min,以10 ℃/min速率升至180 ℃,保留2 min,再以6 ℃/min速率升至230 ℃,保留2 min)；檢測器溫度250 ℃；載氣為He,流速1 mL/min；EI電離源,電子能量70 eV；掃描范圍50～350 amu；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃。

己酸乙酯標準曲線的繪制采用外標法,準確稱取0.086 9 g己酸乙酯純品,用正庚烷定容至100 mL,分別將其稀釋至50、100、200、400、800倍,經GC-MS檢測其峰面積,以己酸乙酯含量為X軸,峰面積為Y軸,繪制己酸乙酯標準曲線。

1.3.7 數據分析

每組試驗進行3個平行,利用Excel 2020處理試驗數據并繪制圖表,采用IBM SPSS Statistics R24.0.0.0進行試驗組間的差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 高產己酸乙酯酵母菌株的篩選

通過傳統分離篩選方法從不同酒廠來源的酒曲中篩選獲得79株酵母,按照方法1.3.2進行發酵,發酵結束后測定其合成己酸乙酯含量,結果表明有37株酵母菌具有合成己酸乙酯的能力(圖1)。但相比產香酵母合成乙酸乙酯的含量(為g/L的水平),酵母合成己酸乙酯的含量都較低,為mg/L的水平,這可能是目前很多濃香型白酒中己酸乙酯與乙酸乙酯含量比降低的原因之一[8]。在產己酸乙酯酵母中,多半產量極低,不足1.0 mg/L,僅有3株酵母產量超過3.0 mg/L,分別為酵母Y1、Y9和Y14,產量分別為3.72、4.15、3.31 mg/L；通過對3株菌株重復驗證發現,酵母Y9合成己酸乙酯含量明顯高于其他2株酵母,為此,將酵母Y9確定為本研究的目標菌株。

圖1 不同酵母發酵液中己酸乙酯含量Fig.1 The yield of ethyl caproate by different yeasts

2.2 酵母Y9的鑒定

2.2.1 酵母Y9形態特征

菌株Y9在YPD固體培養基上長勢良好,菌落乳白色、突起、圓形,表面粗糙干燥、不透明,內部濕潤易挑起(圖2-a)；顯微鏡下細胞形態特征如圖2-b所示,細胞為橢圓形,一端芽殖(圖2-b中橢圓標記),屬酵母的典型特征,另外,還觀察到假菌絲,由此可見,菌株Y9為酵母菌。

a-YPD培養基上菌落形態；b-顯微鏡下細胞形態圖2 酵母Y9在YPD培養基上菌落形態特征及顯微鏡下 細胞形態特征(10×100)Fig.2 Colony morphology of yeast Y9 on YPD culture medium and cell morphology of yeast Y9 captured by microscope(10×100) 注：b圖中橢圓圈出為出芽狀態

2.2.2 生理生化

從表1可知,酵母Y9能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和半乳糖發酵產酸產氣,利用木糖和纖維二糖只產氣不產酸,而不能利用阿拉伯糖、可溶性淀粉和乳糖產酸或產氣。該酵母碳源同化表明,其能很好的適應環境,在所試的16種碳源中均有不同程度的生長,但生長狀態有所差異,主要表現為生長部位不同,這可能是由于該酵母利用不同碳源的代謝途徑不同,有些碳源,如甘露醇、山梨醇、乙醇、海藻糖、檸檬酸、葡萄糖、乳糖等主要通過厭氧途徑,因此菌體主要集中于液體底部,而山梨糖、鼠李糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、可溶性淀粉、麥芽糖、半乳糖和纖維二糖既可通過厭氧途徑也可通過有氧途徑進行同化利用,由此可見,酵母Y9為兼性厭氧微生物。酵母Y9氮源同化結果表明,其能利用KNO3、(NH4)SO4、L-苯丙氨酸和尿素,而不能利用NH4NO2,并且類似碳源同化,利用不同氮源的生長代謝途徑有所不同,利用L-苯丙氨酸主要通過厭氧途徑,而其他3種氮源2種途徑(厭氧和有氧)都可以。在其他生理生化試驗中,則只有吲哚試驗、淀粉水解試驗和尿素試驗為陽性反應,其他都為陰性反應,對比《酵母菌的特征與鑒定手冊》并結合形態學觀察實驗結果,酵母Y9與Hyphopichiaburtonii的形態特征和生理生化最為相似。

2.2.3 酵母Y9分子生物學鑒定

酵母Y9的26S rDNA D1/D2序列與KomagataellapastorisM13-2-1-13的26S rDNA序列同源性最高,相似度達到99.44%。采用Neighbor-Joining方法對該菌株及其序列相似度較高的菌株構建系統發育樹(圖3)。結果表明該酵母與Hyphopichiaburtoniistrain FBKL2.8018的親緣關系最近。綜合形態學、生理生化及分子生物學26S rDNA D1/D2測序試驗結果,酵母Y9被鑒定為Hyphopichiaburtonii。

表1 酵母Y9的生理生化Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain Y9

圖3 酵母Y9基于26S rDNA D1/D2序列及Neighbor-Joining 法構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast strain Y9 using Neighbor-Joining analysis based on the 26S rDNA D1/D2

2.3 特性

白酒釀造環境比較復雜,只有較強環境適應的微生物才能在白酒釀造過程中發揮更好的功能,為此,考察了酵母Y9的生物學特性。結果表明,ρ(NaCl)<150 g/L時,酵母Y9能生長,而當ρ(NaCl)≥200 g/L時,酵母Y9不能生長；酵母Y9具有較好的葡萄糖耐受性,在ρ(葡萄糖)>900 g/L時仍具有生長能力；酵母Y9的最適生長溫度為25 ℃,最高耐受溫度為40 ℃,在20～35 ℃生長旺盛；其最適生長pH為7,具有較寬廣的pH適應性,在pH 2～12都能生長,尤其是在pH 3～10生長旺盛；Y9在乙醇體積分數為8%時能生長,屬中等水平乙醇耐受性菌株[9]；酵母Y9對己酸耐受性較低,在己酸體積分數高于0.04%時生長幾乎停滯,但其具有較高的己酸乙酯耐受性,最高質量濃度為900 mg/L。這些特性表明酵母Y9在白酒釀造中具有一定的應用潛力。

2.4 單因素試驗

2.4.1 溫度對酵母Y9產己酸乙酯的影響

溫度是調控微生物生長和代謝活性的關鍵因素,不同微生物其生長溫度和代謝合成產物的最適溫度會有所差異[10]。實驗表明,酵母Y9合成己酸乙酯的濃度隨溫度的升高先增加后下降,在22～25 ℃時,其合成己酸乙酯濃度達到最高,為4.3～4.5 mg/L,這與其最適生長溫度范圍基本一致,表明其己酸乙酯合成與細胞增長具有一定的正相關(結果未列出),此時的溫度有利于酵母細胞的生長繁殖和代謝合成己酸乙酯相關酶的活力；溫度繼續增高,其生長與代謝合成己酸乙酯相關的酶活力受到影響,從而引起己酸乙酯濃度降低。

2.4.2 轉速對酵母Y9產己酸乙酯的影響

由生理生化結果可知,Y9在不同糖源條件下,代謝途徑有所差異,表現為需氧量不同(表1),即溶氧量會影響Y9發酵代謝途徑及其對應的發酵產物。實驗結果表明,隨著搖瓶轉速的提高,酵母Y9合成己酸乙酯的濃度呈現下降趨勢,即溶氧量的增加會抑制其己酸乙酯的合成,這可能是由于含氧量高會加劇乙醇和己酸對細胞的毒害作用或影響己酸乙酯合成相關酶的表達,繼而導致己酸乙酯的合成降低(結果未列出)[11-12]。在靜置培養方式下,酵母Y9合成己酸乙酯的量最高,達到6.2 mg/L。傳統固態濃香型白酒的釀造是在密封的窖池中進行的,隨著釀造時間的延長,釀造環境逐漸由有氧向微氧、極微氧或厭氧環境轉變,是一個相對缺氧的環境,而酵母Y9的這一特性有助其應用于傳統固態發酵濃香型白酒中。

2.4.3 乙醇添加量對酵母Y9產己酸乙酯的影響

乙醇是酵母合成己酸乙酯的重要前體物質之一,也是影響細胞生長和代謝的重要化學物質,因此,乙醇含量對酵母合成己酸乙酯具有重要的影響[3]。由圖4可知,隨著乙醇濃度的增加,Y9合成己酸乙酯的量呈現先增加后降低的趨勢,其中在乙醇體積分數為8%時,其合成己酸乙酯的量達到最高,為9.1 mg/L。當乙醇較少時,前體物質不足會影響酵母Y9合成己酸乙酯,尤其是在未添加乙醇時,發酵液中未檢測到己酸乙酯,與有乙醇存在情況比較,可以充分表明,乙醇對于酵母Y9合成己酸乙酯具有重要作用；當乙醇含量較高時則會對酵母Y9細胞產生毒害作用,影響其生長和代謝活動,導致其催化乙醇和己酸合成己酸乙酯的活力降低。由此可見,適量的乙醇添加量有助于酵母合成己酸乙酯。與本研究一致,釀酒酵母Y3401合成己酸乙酯的最適乙醇體積分數也為8%[13]。但兩者在未添加乙醇時存在一定差異,這是由于釀酒酵母Y3401能利用高粱酶解液產生少量乙醇,自身提供了合成己酸乙酯的前體,而酵母Y9在高粱酶解液中合成乙醇量極低,在沒有外加乙醇時,很難檢測到己酸乙酯的合成[13]。

圖4 乙醇添加量對酵母Y9產己酸乙酯的影響Fig.4 Effect of ethanol content on the ethyl caproate production by yeast Y9 注：含有相同的字母表示采用Tukey test檢驗時組間 沒有顯著差異(P>0.05)(下同)

2.4.4 己酸添加量對酵母Y3401產己酸乙酯的影響

己酸是酵母合成己酸乙酯的另一重要前體,其對酵母合成己酸乙酯的影響與乙醇類似,因此,需要對其添加量進行考察[14]。如圖5所示,添加適量的己酸有助于酵母Y9合成己酸乙酯,在己酸體積分數為0.04%～0.08%時,其所產己酸乙酯較高,為8.5～9.2 mg/L；當己酸體積分數低于0.04%時,前體物質含量不足,酵母Y9合成己酸乙酯的量較低,尤其是在無己酸時,發酵液中未檢測到己酸乙酯,這足以證實己酸是酵母合成己酸乙酯的重要前體；當己酸添加量較高時,酵母細胞受到損傷,細胞活性降低,導致細胞合成己酸乙酯能力下降,這與酵母Y3401合成己酸乙酯的趨勢類似[13]。值得注意的是,酵母Y9合成己酸乙酯最佳己酸添加量稍高于其己酸耐受的濃度,這可能是由于酵母經過第一階段的培養,細胞生物量已達到較高濃度,此時加入己酸,高濃度的酵母細胞會快速將高毒性的己酸轉化為毒性較低的己酸乙酯,從而減輕己酸對酵母生長代謝的影響,另外,加入己酸后培養溫度的降低及溶氧量的減小,也在一定程度上緩解己酸對酵母的毒害作用。

圖5 己酸添加量對酵母Y9產己酸乙酯的影響Fig.5 Effect of caproic acid content on the ethyl caproate production by yeast Y9

2.4.5 高粱酶解液糖度對酵母Y9產己酸乙酯的影響

鑒于酵母Y9主要用于提高濃香型白酒中己酸乙酯的含量,因此,本研究采用其釀造主要原料高粱的酶解液為發酵培養基探究其合成己酸乙酯能力。結果表明,隨著高粱酶解液糖度的增加,酵母Y9合成己酸乙酯的濃度不斷增加,在糖度為14 °Brix時(酶解高粱所得最高糖度)合成己酸乙酯濃度最高,為12.9 mg/L,這與酵母Y3401類似(結果未列出)[13]。當高粱酶解液中糖度較低時,酵母生長繁殖所需碳水化合物含量不足,影響其所產己酸乙酯含量,隨糖度的增加,酵母生長繁殖所需能源得到補充,代謝活動變得活躍,促進了己酸乙酯的合成。酵母Y9具有較高的糖耐受性及滲透壓耐受性,能適應較高糖度的培養基,因此,較高糖度的高粱酶解液因含有充足的碳源而有利于酵母Y9合成己酸乙酯。不同酵母對糖的耐受性不同,因此,其代謝合成酯類化合物所需糖度存在一定差異。如異常威克漢姆酵母Y3604合成乙酸乙酯所需高粱酶解液最佳糖度為8 °Brix,而異常畢赤酵母Y2合成乙酸乙酯最佳高粱酶解液糖度為12 °Brix[3,15]。

2.4.6 高粱酶解液pH對酵母Y9產己酸乙酯的影響

pH是調控酵母發酵的一個重要參數,不僅影響酵母代謝相關酶活力,而且對培養基中營養物質的狀態產生影響,從而影響酵母對營養物質的吸收和利用,影響其生長和代謝[16]。基于白酒釀造環境偏酸性,因此,我們主要考察酸性條件下酵母Y9合成己酸乙酯的能力。由圖6可知,隨著初始pH的升高,酵母Y9合成己酸乙酯的濃度呈現增加趨勢,在pH 5～7時合成己酸乙酯含量最高,這與其生長pH一致,這可能是pH主要通過影響酵母第一階段細胞的積累來調控其己酸乙酯的合成,即酵母Y9的生物量與己酸乙酯合成量之間存在正相關,這與溫度類似。

圖6 高粱浸出液pH對酵母Y9產己酸乙酯的影響Fig.6 Effect of pH of sorghum extract on ethyl caproate production by yeast Y9

2.4.7 發酵時間對酵母Y9產己酸乙酯的影響

由圖7可知,在未添加前體物質乙醇和己酸時,酵母Y9不能合成己酸乙酯,這與前面結果一致；加入2種前體后,酵母Y9則快速合成己酸乙酯,尤其是在誘導階段的12 h內,能快速將對細胞毒害作用大的己酸轉化為己酸乙酯,此階段己酸乙酯的合成量達到最高質量濃度的79%以上,而后合成速率有所降低,在發酵時間為48～60 h時達到最高,為14.6～15.0 mg/L,繼續延長發酵,己酸乙酯含量有所降低,可能是酵母Y9合成己酸乙酯的速率低于將其轉化為其他化合物的速率。

圖7 發酵時間對酵母Y9產己酸乙酯的影響Fig.7 Effect of time on ethyl caproate production by yeast Y9

3 結論

產香酵母是白酒釀造中的重要功能菌群,影響到白酒風味物質的組成和含量,尤其是酯類化合物的種類和含量。為此,本文從酒曲中篩選獲得1株高產己酸乙酯的酵母菌株Y9,通過形態學觀察、生理生化及分子生物學鑒定其為Hyphopichiaburtonii,該酵母具有較好的NaCl和葡萄糖耐受性,能適應寬廣的pH環境,屬于中等乙醇耐受性菌株,具有一定的己酸和己酸乙酯耐受性,優化得到其產己酸乙酯條件,在高粱酶解液培養基糖度為14 °Brix,初始pH 5.0,乙醇體積分數為8%,己酸體積分數為0.04%,誘導溫度為22 ℃,誘導階段采用靜置,發酵60 h時,己酸乙酯質量濃度達到15.0 mg/L,是優化前的3.6倍。由此可見,酵母Y9具有在濃香型白酒釀造中應用的潛力。