豬偽狂犬病活疫苗（SA215株）保存條件的研究

陰文奇，張傳明，何平元，王子建，周遠成，李盛辟

（1.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；2.畜科生物工程有限公司，四川 成都 610299；3.畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都 610299）

豬偽狂犬病（PR）是由偽狂犬病毒（PRV）所引起的多種家畜和野生動物以發熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。豬是該病的天然宿主和主要儲存宿主，各個年齡段的豬群均可感染［1-3］。該病在世界上分布廣泛，并有不斷蔓延擴大的趨勢。疫苗免疫是防控豬偽狂犬病最經濟、有效的方法。目前市場上流通的偽狂犬病疫苗有滅活疫苗和活疫苗。隨著PRV 的基因變異，以Batha-K61 株為首的疫苗毒株對我國豬偽狂犬病的預防能力降低。郭萬柱等［4］根據我國豬偽狂犬病疫情的流行情況，以野毒Fa 株為親本毒株構建了三基因（TK、gE、gI）缺失疫苗SA215 株，該疫苗株具有良好的穩定性和安全性［5-6］。該活疫苗的有效期為2～8 ℃保存12 個月。為研究保存期延長對疫苗的影響，本試驗將保存期延長至21 個月后按照質量標準進行檢測，為臨床使用和后續產品開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料 6 批豬偽狂犬病活疫苗樣 品（批 號：試201906021、試201906022、試201906023、試 201906024、試 201906025、試201906026）由畜科生物工程有限公司生產，每批取樣150 瓶置-15 ℃保存，取150 瓶置2～8 ℃保存。Vero細胞，由畜禽生物制品四川省重點實驗室鑒定、保管和供應。DMEM 購自Gibco 公司。新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司。21～28 日齡斷奶健康易感仔豬購自成都周邊散養戶。

1.2 不同保存期疫苗病毒含量的測定 在保存試驗前以及-15 ℃和2～8 ℃保存6、12、18、21 個月時分別取保存樣品用維持液將疫苗成品稀釋至1 頭份/mL，再作10 倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個稀釋度，每個稀釋度分別接種6孔板內培養形成的致密Vero 細胞單層1 孔，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h。再于每孔加入DMEM 液（含甲基纖維素0.5%）2～3 mL，置二氧化碳培養箱37 ℃培養3～4 日，吸去上清液，用1%結晶紫、福爾馬林染液染色20 min，棄染色液，計算蝕斑數，應≥105.0PFU/頭份。

1.3 常規檢測指標的測定 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 個月的疫苗，按照《中國獸藥典》（2015年版）附錄19進行無菌檢驗、附錄22進行支原體檢驗、附錄16 第2 法進行外源病毒檢驗、附錄11 進行剩余水分測定、附錄7 進行真空度檢驗。

1.4 鑒別檢驗 將疫苗稀釋成104.0PFU/mL，與PRV特異性血清（中和指數為700～1 000）等量混合，37 ℃中和1 h，同時設病毒對照，分別接種Vero細胞單層。置二氧化碳培養箱37 ℃培養3～5日，觀察細胞病變（CPE）。病毒對照組應出現細胞圓縮、融合形成空斑等細胞病變，中和組不能出現CPE。

1.5 安全性檢驗 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21個月的疫苗，給2頭20～22日齡健康易感仔豬（PRV 中和抗體效價≤1∶4）各肌肉注射2頭份，觀察7日并記錄。

1.6 效力檢驗 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 個月的疫苗，給4 頭20～22 日齡健康易感仔豬（PRV 中和抗體效價≤1∶4）各肌肉注射1 頭份。28 日后，連同條件相同的4 頭對照豬，分別采血，分離血清，測定血清中和抗體滴度。

2 結果

2.1 6 批豬偽狂犬病活疫苗（SA215 株）不同保存期的病毒含量檢測結果 將6 批成品苗在-15 ℃下保存6、12、18、21 個月后分別檢測各批樣品的病毒含量，結果顯示：18 個月時病毒含量下降幅度在0.5～0.7 個滴度之間，21 個月時下降幅度在0.6～0.8 個滴度之間，但所有批次的病毒含量均遠高于105.0PFU/頭份的國家標準。詳見表1。

表1 6批成品苗在-15 ℃條件下放置不同時間后的病毒含量檢測

將6 批成品苗在2～8 ℃下保存6、12、18、21個月后分別檢測各批樣品的病毒含量，結果顯示：18 個月時病毒含量下降幅度在0.5～0.8 個滴度之間，21 個月時下降幅度在0.6～0.9 個滴度之間，但所有批次的病毒含量均遠高于105.0PFU/頭份的國家標準。詳見表2。

2.2 6 批成品苗在-15 ℃及2～8 ℃保存12 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存12 個月，然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示所有指標均符合質量標準要求。詳見表3和表4。

表3 6批成品苗于-15 ℃保存12個月時的檢測結果

表4 6批成品苗于2～8 ℃保存12個月時的檢測結果

2.3 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存18 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存18 個月，然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示：病毒含量均在105.7PFU/頭份以上，免疫抗體均在1∶30 以上，所有指標均符合質量標準。詳見表5和表6。

表5 6批成品苗于-15 ℃保存18個月時的檢測結果

表6 6批成品苗于2～8 ℃保存18個月時的檢測結果

2.4 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存21 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存21 個月，然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示：病毒含量均在105.6PFU/頭份以上，免疫抗體均在1∶30 以上，所有指標均符合質量標準。詳見表7和表8。

表7 6批成品苗于-15 ℃保存21個月時的檢測結果

表8 6批成品苗于2～8 ℃保存21個月時的檢測結果

3 結論

臨床上使用的動物活疫苗均以凍干形式生產、保存，近年來隨著真空冷凍干燥技術的發展出現了耐熱保護劑活疫苗。常規疫苗通常在-15 ℃保存，而耐熱保護劑活疫苗則在2～8 ℃保存。本試驗使用的疫苗在取得新獸藥證書時確定的質量標準為2～8 ℃保存12 個月，為研究該疫苗在不同溫度條件下保存的穩定性和有效期，本試驗以12 個月有效期為基礎，分別選擇三個批次的疫苗在-15 ℃和2～8 ℃保存，將保存期延長至21個月，并在保存后不同時間段取樣進行疫苗質量測定。試驗得出：6 批豬偽狂犬病活疫苗（SA215株）試制產品在-15 ℃和2～8 ℃下保存21 個月，病毒含量只有輕微下降（0.6～0.8 和0.6～0.9），每頭份病毒含量均在105.6PFU以上，遠高于國家質量標準（105.0PFU/頭份）；免疫抗體水平均高于1∶30；性狀、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗、安全性、效力、剩余水分、真空度等指標均符合質量標準，表明該疫苗在-15 ℃及2～8 ℃兩種溫度條件下保存21 個月仍然合格。本試驗結果為疫苗的臨床推廣以及后續新產品的開發提供了新的依據。■