雙胎妊娠合并胎兒染色體異常的產前診斷方法*

鄭嬌 宋婷婷 徐盈 李佳 楊紅

(空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科，陜西 西安 710032)

雙胎妊娠屬于高危妊娠，雙胎圍產期并發癥較單胎明顯增加，在為雙胞胎異常妊娠的父母提供咨詢時，相關的早產風險是一個重要因素，因為雙胞胎異常分娩時的平均孕周為35.7周[1]。雙胞胎的先天性異常差異很大，可能影響一個或多個器官系統，且雙胎尤其是異卵雙胎的血清學篩查及無創檢查結果不能準確表明胎兒的體征情況，故雙胎介入性產前診斷的需求日益增加。本研究回顧性分析來我院進行遺傳咨詢的353例雙胎妊娠孕婦，分析其介入性產前診斷指征和染色體結果以及染色體異常胎兒的妊娠結局。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究選取2014年1月～2020年8月來我院進行產前診斷的雙胎孕婦共353例，產前診斷孕周為18～33周。經產前遺傳咨詢，孕婦及家屬簽署知情同意書后，進行羊水穿刺術及胎兒染色體核型分析。

1.2 羊膜腔穿刺 羊水樣本采集經B超引導定位，在無菌條件下，采用羊水專用穿刺針經腹部穿刺，抽取30 mL羊水，其中15 mL用于羊水細胞培養進行后續染色體G顯帶分析，另外15 mL進行染色體微陣列芯片檢查。

1.3 染色體G顯帶核型分析 將新鮮抽取的羊水轉入15 mL無菌離心管1500 r/min離心5 min，去上清留沉淀，分別接種于兩個培養瓶中，加入羊水細胞培養基，于37℃、5% CO2培養箱中進行培養。由于羊水細胞生長方式為貼壁生長，5～7天后換液一次，一般培養8～10天后，待形成密集的細胞克隆6個以上后收獲細胞。棄上清，用0.25%胰酶消化細胞5 min，終止消化后將細胞移入離心管中2000 r/min離心，用含1%檸檬酸鈉和0.075氯化鉀(1∶1)的低滲液低滲10 min, 用3∶1的固定液(甲醇：冰醋酸)預固定，1500 r/min離心棄上清，再以3∶2的固定液(甲醇：冰醋酸)固定兩次后，于染色體分散室中常規制片，G顯帶，然后進行羊水細胞染色體核型分析。每份標本至少計數30個分裂相，分析8～10個分裂相并保存圖片，核型描述按照人類細胞遺傳學命名國際體系ISCN 2016。

1.4 染色體微陣列分析(CMA) 按照Qiagen試劑盒(QIAamp DNA blood mini kit)操作說明提取基因組DNA。按照AffymetrixCytoScanTM750K芯片檢測標準操作流程對基因組進行酶切、連接、PCR擴增、純化、片段化、標記、雜交及掃描，通過ChAS(Chrosome analysis suite)軟件進行結果分析。對包含的連續探針數目≥50、片段長度≥100 kb的缺失和重復以及片段長度≥10 Mb的雜合性缺失進行分析，通過與NCBI、OMIM、DECIPHER Database、ISCA等公共數據庫進行對比分析所檢出CNV的性質。

2 結果

2.1 異常核型統計結果 353例雙胎胎兒中，核型正常胎兒338例(95.75%)，異常核型15例(4.25%)，見表1。結構異常見表2，標記染色體見表4序號14。

表1 染色體異常核型檢查結果

表2 檢出異常核型中結構異常核型表

2.2 雙胎孕婦合并不同產前指征與染色體結果 通過總結353例雙胎孕婦中，雙胎合并超聲異常、無創DNA檢測結果異常、不良孕產史等檢查指征進行分類統計分析，并對各類胎兒羊水染色體核型結果進行統計，分析各組中出現的染色體異常例數及在異常總數中所占比例，見表3。單純雙胎查體中異常核型，見表4。患者12。雙胎合并血清學異常中的結果異常，見表4。患者5。雙胎合并神經系統異常中核型異常，見表4。患者13、15。雙胎合并心臟異常中染色體異常，見表4。患者1，患者14。雙胎合并腸管發育異常中異常結果，見表4。患者6。雙胎合并無創DNA檢測結果異常，見表4。患者3、4、7、8、9、10。雙胎合并其他異常中核型結果異常，見表4。患者2、11。

表3 不同產前診斷指征異常核型檢出情況

2.3 核型異常患者結合CMA結果及其妊娠結局 本研究15例異常核型中，患者1～13(表4)核型結果與CMA結果一致為致病性，妊娠結局都是引產。患者14(表4)CMA結果為意義不明確CNV，經遺傳咨詢后，孕婦選擇繼續妊娠，于孕36周剖腹產下一4.4斤健康男嬰。患者15(表4)CMA結果正常，證明在染色體易位過程中沒有基因的缺失或重復，核型為平衡易位，37周剖腹產一健康4.6斤男嬰。

2.4 核型正常CMA異常結果分析及妊娠結局 本研究中患者16～22(表4)核型結果正常，其中患者17、18 CMA結果良性變異，但患者17因其超聲嚴重異常為腹裂，孕婦決定引產；患者18為先心病，經遺傳咨詢后繼續懷孕，后行剖宮產，胎兒于出生15天后夭折。

表4 CMA檢測結果為致病、意義不明確及隨訪結果異常的胎兒具體情況

3例CMA結果意義不明確，患者16選擇引產；患者20也選擇繼續妊娠，足月順產后超聲顯示其脈絡膜囊腫消失，孩子健康；患者22繼續妊娠后行剖宮產，胎兒于出生后由于心臟異常夭折。

2例CMA結果可能致病，患者19孕婦經遺傳咨詢后決定繼續妊娠，后行剖宮產，生下一男孩有臍疝、腹股溝疝，后續情況我們會繼續追訪；患者21失訪。

3 討論

近年來，隨著輔助生殖技術的廣泛應用及高齡孕產婦比例增加，雙胎妊娠的比例逐步上升[2-3]。雙胎妊娠的死亡率、患病率、流產率、胎兒畸形率、染色體異常風險明顯較單胎高[4-5]。據統計，雙胎出生缺陷的發生率為6.3%，遠高于單胎，且雙胎妊娠的產前篩查和產前診斷復雜，準確性差并且咨詢難度更大[6]。雙胎妊娠的合子性決定了雙胎妊娠染色體風險是否相同,單卵雙胎遺傳物質完全一致,而異卵雙胎發生染色體異常風險相互獨立。雙胎產前篩查推薦早孕期多項指標及多種篩查手段的聯合應用，以提高檢出率，因此，所有雙胎都應接受產前篩查，超聲篩查是早孕期篩查的重要手段，可直觀監測胎兒生長狀態，明確其絨毛膜性[7-8]。目前并不推薦雙胎妊娠單獨進行血清學篩查,其準確性受到胎盤、胎兒鑲嵌、孕早期一胎死亡、單絨雙胎遺傳物質不一致等原因影響準確性[6，9-13]。而對于無創DNA檢測，其檢測效率雖優于傳統篩查方法[14]，但是對于異卵雙胎及雙胎中一胎消失的情況會影響無創DNA檢測的準確性。當無創DNA檢測結果為高風險時并不能依此診斷異常胎兒，必須通過介入性產前診斷進行確診。

雙胎妊娠的介入性產前診斷應用最廣泛的是絨毛膜取樣術和羊膜腔穿刺術[15]。對于雙絨雙羊雙胎需分別對兩個胎兒取樣，單絨雙胎只需取一個胎兒樣本，單絨雙胎其中之一或兩者都出現血清學和超聲異常尤其是結構異常時需分別對兩個胎兒都取樣[16-17]。介入性產前診斷取樣的準確性直接影響雙胎染色體異常的精準診斷。近年來染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用尤其是在超聲檢查指標異常胎兒中應用廣泛，對于染色體的微重復微缺失等細微結構異常及單親二倍體或局部單親二倍體可通過染色體微陣列分析來檢測。而染色體G顯帶核型分析依舊是產前診斷的金標準[18]，可以直觀地發現其他基因檢測技術無法發現的易位、倒位等染色體異常。因此，產前診斷需要將核型分析與其他診斷技術結合起來，才能做到不漏檢。

從本研究患者檢查指征分類情況進行分析，雙胎合并高齡孕婦和雙胎合并心臟異常的歸類占比較高。多胎妊娠發生率會隨著高齡妊娠人群的增加而增加，其圍產期并發癥的發生率也隨之增高，但高齡是否是雙胎的不良妊娠結局的獨立危險因素以及影響大小還需要更多的病例總結研究來證明。但高齡可直接或者間接通過表觀遺傳、DNA甲基化、染色質重構等遺傳因素以及生化和代謝過程影響機體，從而影響胎兒尤其是高齡雙胎疾病的發生、發展[19]。胎兒先天性心臟異常是先天性異常中致死率最高的疾病之一，近年來呈逐漸上升趨勢[20-22]。先天性心臟病多由單基因、多基因、染色體畸變引起。染色體數目及結構的異常均可導致先天性心臟病或是合并其他異常共同發生。本研究中患者2檢查指征為心臟異常，其核型結果為21三體綜合征，而先天性心臟畸形是該綜合征的常見臨床表現之一，常染色體綜合征如21三體綜合征、13三體綜合征、18三體綜合征、及性染色體異常的Turner綜合癥、69,XXY、69,XXX、69,XYY三倍體綜合征以及DiGeorge綜合征、22q11微重復綜合征等微缺失綜合征也常伴隨心臟異常。

本研究患者15染色體微陣列分析結果正常，證明該染色體易位為平衡易位。該患者是非同源染色體間的相互易位的攜帶者，染色體平衡易位因其無遺傳物質丟失[22]，故表型正常，根據后期隨訪也表明該胎兒出生后表型正常。而患者14中的標志染色體經CMA分析表明其為一無明確臨床意義的21q21.1區域2.1 M的重復。患者19、21皆核型結果正常，CMA結果為可能致病，其中患者19包含5q21.3q22.1約1.12 Mb的重復及8q12.2約440 kb的重復，包含部分CHD7 OMIM基因，該基因突變與顯性CHARGE綜合征相關；患者21 檢出15q11.2區域有約518 kb的重復，該區域包含TUBGCP5,CYFIP1,NIPA2,NIPA1 4個OMIM基因，該區域的重復與神經系統相關疾病有關，但具有不完全外顯率，外顯率相對較低，患者臨床表現不一致[23]。以上患者皆體現了CMA在染色體微缺失微重復檢測的優勢。這4個患者進一步體現了在介入性產前診斷中羊水核型染色體分析與染色體微陣列分析技術相結合的重要性。

4 結論

雙胎妊娠一直都是圍產醫學和胎兒醫學研究的重點，多胎妊娠染色體和胎兒結構異常等風險均高于單胎妊娠，應加強產前篩查，對于有高危指征的雙胎，介入性產前診斷的廣泛應用可有效降低雙胎妊娠的出生缺陷。