SLC及其受體CCR7與Ⅰ期非小細胞肺癌淋巴結微轉移的相關性*

裴艷志 聶美楠 姜騰蛟 王曉強 李春磊 路通 朱曉峰 鄒志田

(佳木斯大學附屬第一醫院 1.胸外科； 2.病理科,黑龍江 佳木斯 154007)

早期非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中預后較好的一類，但其切除后復發率高達30%左右，對患者遠期生存造成了不利影響[1-2]。目前臨床上對于NSCLC行根治術后的淋巴結檢測發現部分患者淋巴結中存在有單個或直徑小于0.2 mm的癌細胞簇，而此類患者術后復發的幾率顯著較大，說明微轉移對于患者預后具有顯著的相關性[3]。由于微轉移是較少的癌細胞轉移后造成，故極易被正常組織細胞覆蓋，通過影像學及實驗室檢查很難對其進行診斷，故目前臨床上通過PCR及免疫組化法對相關標記物的檢測成為NSCLC的主要診斷方式[4-5]。溶質載體(Solute carrier，SLC)家族是負責人體細胞膜內外氨基酸、核苷酸、糖及無機離子轉運的重要載體，對于細胞分裂及正常生理活動具有顯著的影響，以往研究提示，SLC家族中的SLC7A11與部分惡性腫瘤的轉移、耐藥及凋亡等活動過程顯著相關[6]。而趨化因子受體7(Chemokine receptor 7，CCR7)作為激活細胞免疫的重要介質，在NSCLC發生和發展過程中具有至關重要的作用，同時作為SLC家族的高親和度受體，CCR7與SLC之間存在互相影響的情況[7]。目前國內外將上述兩個因素用于預測Ⅰ期NSCLC淋巴結微轉移的相關研究較少，故開展本研究，旨在進一步完善早期NSCLC病情的評估，為制定臨床治療方案打下良好基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月～2020年3月于我院就診的I期NSCLC患者。納入標準：①符合《中華醫學會肺癌臨床診療指南(2018版)》中對于Ⅰ期NSCLC診斷的相關標準[8]。②患者均達到手術切除指征并耐受手術。③患者依從性較好且知情同意并接受完整的療程。排除標準：①伴有除NSCLC外的其他惡性腫瘤疾病。②既往NSCLC手術或治療史。③嚴重的器官功能障礙。④近期肺部炎癥或全身性感染性疾病。⑤1月內抗生素使用史。⑥營養狀態正常。符合上述標準并與患者簽訂知情同意書后共計納入患者127例。其中，患者平均(53.47±11.29)歲；男性89例，女性38例；ⅠA1期33例，ⅠA2期42例，ⅠA3期24例，ⅠB期28例。按照淋巴結微轉移情況分為對照組(n=92)與轉移組(n=35)兩組。

1.2 方法

1.2.1 手術治療方案 所有患者入院后均行常規檢查，并通過影像學檢查資料確定手術方案，擇期行NSCLC根治術并按照《中華醫學會肺癌臨床診療指南(2018版)》[8]中相關標準進行淋巴結清掃，術后切除肺組織及淋巴結送活檢。

1.2.2 病灶組織免疫組化分析 收集的組織標本均經 10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片，HE染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法，一抗選用SLC7A11及CCR7，二抗選用HRP標記聚合物。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，每張切片均設陽、陰性對照，見圖1。

圖1 典型免疫組化圖片

1.2.3 蛋白表達評分 由兩名有經驗的病理醫師采用雙盲法閱片，以腫瘤細胞有定位準確、染色清晰的黃色顆粒為陽性。按照陽性細胞所占百分數與染色強度分別評分，兩項分數相乘得到抗體表達水平評分，以此作為陽性判定標準[9]。陽性細胞百分數:<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度:無陽性染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。抗體表達水平評分0～1分為(-)，2～4分為(+)，6～8分為(++)，9～12分為(+++)。

1.3 觀察指標及評判標準

1.3.1 微淋巴結轉移評價標準 根據患者術中淋巴結清掃送檢后細胞檢查結果，參照美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的診斷標準：在常規病理檢查陰性的淋巴結中檢測到單個腫瘤細胞或腫瘤細胞團的最大直徑<0.2 mm[10]。

1.3.2 臨床資料收集 收集患者年齡、性別構成、吸煙史及基礎疾病。

1.3.3 實驗室檢查資料收集 病灶內SLC7A11及CCR7的免疫組化結果、病理分型、分化程度。

1.3.4 影像學檢查資料收集 病灶直徑、病灶位置、腫瘤類型、受累部位、磨玻璃樣影及PET/CT檢查結果(SUVmax及TLG)。

1.4 統計學分析 數據采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，計數資料采用n(%)表示，采用2檢驗比較組間差異，等級資料采用等級資料比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗，理論頻數<1采用Fisher確切概率檢驗；計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗；采用二元Logistic回歸分析 SLC及CCR7與I期非小細胞肺癌淋巴結微轉移之間的相關性；采用ROC曲線分析SLC及CCR7對I期非小細胞肺癌淋巴結微轉移的預測性，并計算曲線下面積(Area under the curve，AUC)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 影響NSCLC微淋巴結轉移的單因素分析 兩組患者SLC7A11及CCR7表達水平存在顯著差異(P<0.05)，見表1。

表1 影響NSCLC微淋巴結轉移的單因素分析[n(×10-2)]

2.2 影響NSCLC微淋巴結轉移的單因素分析 轉移組患者病灶直徑、支氣管受累及TLG顯著高于對照組(P<0.05),見表2。

表2 影響NSCLC微淋巴結轉移的單因素分析[n(×10-2)]

2.3 影響NSCLC微淋巴結轉移的Logistic回歸分析 根據單因素分析結果，將淋巴結微轉移情況作為因變量(1=是，0=否)；將單因素分析存在差異的項目作為自變量(表3)進行二元Logistic回歸分析，結果顯示：病灶直徑(OR=49.254,95%CI=11.062～507.604)是影響NSCLC淋巴結微轉移的獨立危險因素(P<0.05)；SLC7A11(OR=8.622)及CCR7(OR=8.709)表達水平是影響NSCLC淋巴結微轉移的獨立因素，其中相較于SLC7A11表達“+++”，表達“-”

表3 影響NSCLC微淋巴結轉移的Logistic回歸分析賦值

(OR=0.053,95%CI=0.006～0.494)、是影響NSCLC淋巴結微轉移的保護因素；而相較于CCR7表達“+++”，表達“-”(OR=0.051,95%CI=0.007～0.404)是影響NSCLC淋巴結微轉移的保護因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響NSCLC微淋巴結轉移的Logistic回歸分析

2.4 SLC7A11及CCR7表達水平對NSCLC患者淋巴結微轉移的預測性分析 通過ROC曲線分析SLC7A11、CCR7及聯合診斷對NSCLC微淋巴結轉移診斷效能之間的差異，結果顯示SLC7A11、CCR7及聯合診斷NSCLC淋巴結微轉移具有較好的檢測價值(均P<0.05)，見表5、圖2。分析3種檢測方式對于NSCLC患者淋巴結微轉移的預測效能結果顯示，聯合檢測特異度顯著高于 SLC7A11及CCR7單獨檢測(2=7.292，15.125；均P<0.01),見表6。

表5 SLC7A11及CCR7表達水平對NSCLC患者淋巴結微轉移的預測性分析

表6 SLC7A11及CCR7表達水平及聯合檢測對NSCLC患者淋巴結微轉移的診斷的效能(×10-2)

圖2 SLC7A11及CCR7表達水平對NSCLC患者淋巴結微轉移的ROC曲線

3 討論

早期NSCLC患者通過手術及有效的放化療可以顯著提升5年內生存率，但是相關研究顯示，判斷患者淋巴結微轉移情況對于患者手術方案及術后放化療方案具有至關重要的作用[11-12]。對于NSCLC發生微小淋巴結轉移進行病理診斷是目前臨床中的金標準，但是尋找被癌細胞侵犯的微小淋巴結難度較大，通過影像學、穿刺活檢等檢出率相對較低，這給目前NSCLC微小淋巴結轉移的診斷帶來了極大的困難。既往對于患者淋巴結微轉移通常采用癌灶部位免疫組化標記物進行了大量研究，提出角細胞蛋白及其抗體在NSCLC細胞中表達異常且可以作為淋巴結微轉移的預測指標[13]。但也有研究提出免疫組化檢測方式的敏感度高，但特異度相對較低，其主要原因與標記物的特異度有顯著關系，故需要尋找新的免疫組化標記物，提升預測的可靠程度[14]。

本研究中，共計35例患者發生了微小淋巴結轉移，發生率為27.5%，這一結果與黃斌等[15]研究中的26.7%相近，說明微小淋巴結轉移在NSCLC患者中屬于較為常見的轉移方式。SLC是體內重要的基因家族，其包含大約 60 多個亞型，主要參與體內轉運蛋白的編碼，而其中的SLC7是參與氨基酸轉運的重要介質。SLC7A11基因作為SLC7中重要成員，在人體腦、肝等重要組織及巨噬細胞、淋巴細胞等免疫系統重要細胞中均有表達[16-17]。而其編碼的SLC7A11蛋白與 SLC3A2組成胱氨酸/谷氨酸反轉運體，是細胞活動的重要參與因素[18]。本研究結果顯示，SLC7A11與NSCLC淋巴結微轉移有顯著的關系。通過動物實驗結果顯示，通過抑制SLC7A11表達可調節caveolin-1/β-catenin通路，進而增強腫瘤細胞間的黏附，削弱細胞-細胞外基質的黏附，促使NSCLC腫瘤細胞局限于原發灶，降低其擴散或侵襲力[19-20]。同時當癌細胞出現葡萄糖耗竭時可通過 ATF4 和 NRF2 轉錄因子誘導 SLC7A11 表達來促使NSCLC細胞葡萄糖缺乏條件下的癌細胞存活，進而滿足NSCLC細胞在缺乏營養條件下的分裂復制，故抑制SLC7A11表達的基因可以進一步阻斷癌細胞分裂復制能力，降低其侵襲度[21]。通過以上研究能看出，SLC7A11高表達可以增強NSCLC細胞的侵襲轉移能力，故其與NSLCLC細胞微淋巴結轉移顯著相關。而Zhang等[22]的研究提出，作為SLC受體的CCR7其主要作用在激活局部的免疫反應，促進巨噬細胞、淋巴細胞等異常表達，在SLC7A11異常表達激活CCR7后會導致局部炎性反應加重，從而導致血管及淋巴管通透性增加，達到促進癌細胞轉移的可能性，而本研究中也得出了CCR7表達量與NSCLC淋巴結微轉移顯著相關的結論。同時Pu等[23]研究中提出，作為CCR7配體的CCL21在人體的淋巴管內皮細胞內高表達，故推測NSCLC細胞中CCR7高表達時受到淋巴管內CCL21吸引可能是特異性介導NSCLC淋巴結轉移的重要因素。本研究中還指出，腫瘤直徑、支氣管受累及TLG與NSCLC患者微淋巴結轉移有關，其中腫瘤直徑與疾病分期顯著相關，瘤體較大患者其病程時間及癌細胞分裂情況相對較重，故發生微轉移的可能性也相對較大；其次支氣管上具有淋巴管及淋巴結等系統，當癌細胞侵犯支氣管時可能通過侵犯淋巴結及淋巴管從而導致淋巴結微轉移；而TLG是反應病灶糖酵解的重要指標，在Hensley等[24]研究中顯示，糖酵解是NSCLC細胞分裂的能量主要提供途徑，TLG高意味著患者局部NSCLC細胞分裂活躍，故發生淋巴結微轉移的可能性也顯著上升。

通過多因素分析結果卻將支氣管受累及TLG排除NSCLC微淋巴結轉移的獨立影響因素，可能有以下原因：①由于本次納入為Ⅰ期NSCLC患者，發生淋巴結轉移的可能性相對較小，同時局部糖酵情況解受到機體調節影響因素較多，故削弱了上述兩個指標與NSCLC微淋巴結轉移的相關性。②本次納入樣本量相對較少，結果出現偏倚的可能性較大。而結果中作為NSCLC微淋巴結轉移的獨立影響因素的SLC7A11及CCR7表達水再次證實了上述兩組指標與NSCLC微淋巴結轉移的相關度較高，可以作為預測微淋巴結轉移的指標。但在之后建立ROC曲線后發現，兩者特異度均低于80%，結合之前研究中提出目前臨床上需要提升檢測特異性的要求，對兩者進行并聯后再次對NSCLC患者淋巴結微轉移進行預測，結果將檢測特異度提升至91.25%，達到了預期的實驗目標。但聯合檢測并未進一步提升檢測的敏感度，故在今后的研究中可以結合以往常用的PCR及免疫組化指標進行預測，進一步完善對NSCLC患者微淋巴結轉移的預測效能。

4 結論

SLC家族的中SLC7A11及其受體CCR7與NSCLC患者微淋巴結轉移顯著相關，通過兩者聯合檢測還能有效提升NSCLC患者微淋巴結轉移預測特異度，但將其應用于NSCLC臨床診斷尚需要更多研究予以充分驗證。

至謝：佳木斯大學公共衛生學院張紫萱老師在統計學方面給予的幫助和指導。