補腎活血方對人胚肺成纖維細胞中IL-17A的影響*

劉曉明 李芮 高善語

(山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014)

特發性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)為發病原因不明的間質性肺疾病，目前臨床缺乏特效的治療藥物且無有效治療方法。中醫學常將其歸入“肺痹”的范疇。其中，細胞外基質的過度沉積是肺纖維化的主要病理改變[1]，而細胞自噬正是保護細胞穩態的重要途徑。近年來研究發現，細胞自噬調節與肺纖維化的發病密切相關，其通過參與成纖維細胞活化、肌成纖維細胞分化和細胞外基質沉積等途徑促進肺纖維化[1-4]。進一步研究發現，阻斷IL-17A的活性，可激活細胞自噬的發生，進一步阻止中晚期膠原蛋白的異常沉積。因此，通過阻斷IL-17A靶向調控自噬有望成為肺纖維化診療的新靶點和方向[5-6]。本實驗應用補腎活血方對造模后的人胚肺成纖維細胞進行干預治療，旨在觀察IL-17A的含量，探討補腎活血方在肺纖維化中的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株、主要試劑和儀器 人胚肺成纖維細胞MRC-5(南京凱基生物科技發展有限公司)；MEM培養基(美國GIBCO)；胎牛血清 FBS (Gibco, 10099-141)(賽默飛世爾科技有限公司)；雙抗：(南京凱基生物科技發展有限公司)；TGF-β1細胞因子(派普泰克生物科技有限公司)；CCK8(日本同仁化學研究所)；定量PCR試劑盒(寶日醫生物技術有限公司)；二甲亞砜(DMSO) (Aladdin，B1328005)(西格瑪奧德里奇貿易有限公司，批號：RNBJ1841)。1640 培養液(Gibco,1171219)(南京凱基生物科技發展有限公司)，磷酸緩沖液 PBS(南京凱基生物科技發展有限公司)。

1.2 主要實驗儀器與設備 超凈工作臺(蘇州凈化SW-CJ-IFD)；RE200A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；HERACELL 150i二氧化碳恒溫培養箱(日本SANYO)；IX73顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；臺式低速離心機(中國上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠)；高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter)；SYNERGY4酶標儀(美國BioTek)；EPS-300水平電泳儀(上海天能科技有限公司)；VE-186蛋白轉膜儀(上海天能科技有限公司)；VE-180蛋白電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方案

1.3.1 補腎活血方血清制備 ①補腎活血方中藥湯藥制備：根據人的用藥量(人參9 g，黃芪30 g，熟地黃15 g，山茱萸9 g，麥冬15 g，五味子6 g，當歸15 g，丹參15 g，黃芩12 g，川貝母6 g，虎杖12 g，炙甘草6 g)，結合人和動物體表面積折算的等效劑量比值表分別計算。將8倍新西蘭兔等效劑量的中藥準確稱取，加入8倍量的水浸泡后煎煮，水沸后小火煎煮約30 min后濾出藥液；然后，再次加入6倍量的水繼續煎煮20 min濾出藥液。將兩次藥液合并后過濾濃縮，濃度為3 g/mL，置4℃冰箱保存備用。②制備過程：健康新西蘭兔隨機分為含藥血清組和正常血清組。給予8倍新西蘭兔等效劑量的中藥灌胃，給藥量為56 g/kg(生藥量)，灌胃前禁食不禁水12 h，每天1次，連續給藥7天后，第7天灌胃1次，給足1天劑量。末次給藥后1 h在家兔自然清醒狀態下，以1%利多卡因5 mL腹腔內注射麻藥后從腹主動脈采血。血液于37℃下靜置1 h，待凝血后以5000 r/min離心10 min，常規分離血清，并將同組家兔的血清合并，56℃水浴30 min滅活補體，用0.22 μm醋酸纖維素膜過濾除菌，-20℃保存備用。正常血清組：以生理鹽水灌胃，相同方法釆血制備血清。

1.3.2 實驗細胞的培養 使用含10%的牛胎血清的不完全DMEM培養基，置入5% CO2、37℃培養箱中培養MRC-5細胞，當培養瓶內細胞生長達80%左右時，用胰酶消化傳代，選擇第 3～4 代細胞用于下述實驗。

1.3.3 實驗分組及藥物干預 參照文獻[7-8]，確定TGF-β1誘導成纖維細胞活化的最佳濃度及時間，TGF-β1誘導成纖維細胞活化的最佳濃度為5 ng/mL，最佳刺激時間為48 h。

實驗分組一：對照組，含藥血清(1倍)組，含藥血清(1/2倍)組，含藥血清(1/4倍)組，含藥血清(1/8倍)組，含藥血清(1/16倍)組，含藥血清(1/32倍)組，含藥血清(1/64倍)組，含藥血清(1/128倍)組。

實驗分組二：空白組(A組)，TGF-β1造模組(B組)，TGF-β1處理+最佳濃度含藥血清干預1 h組(C組)，TGF-β1處理+shRNA-IL-17A組(D組)，TGF-β1處理+最佳濃度含藥血清干預1 h+IL-17A過表達質粒組(E組)。

1.3.4 MTT法測定不同濃度含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖的抑制情況 將細胞隨機分為正常組(正常DMEM培養基)及不同稀釋濃度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)含藥血清干預組等9組，每組8個復孔。置于37℃ 5%CO2培養箱中，于培養24 h后，吸棄培養液，培養板每孔加入20 μL MTT液，培養箱中孵育4 h后，吸棄 MTT液，加入DMSO，震蕩搖勻后在避光孵育15 min，選擇波長490 nm處，酶標儀讀取各孔OD值并記錄。統計每組OD值，每組實驗重復操作3次。

1.3.5 觀察各組細胞形態、結構的變化 熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態、結構的變化。

1.3.6 CCK8法檢測含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖的影響 將人胚肺成纖維細胞以1×105/孔接種于96孔板，培養24 h，當細胞貼壁后，各干預組加入不同溶液，空白對照組加入等量PBS溶液，作用24 h，吸去上清，除空白對照組外，每孔加入TGF-β1繼續培養48 h。然后將96孔板中對應孔更換100 μL新的培養基，分別加入10%的CCK8，放入培養箱中繼續培養，4 h后取出，放入酶標儀中，450 nm測OD值。細胞生長抑制率公式如下：細胞抑制率=[(模型對照組OD值-干預組OD值)/模型對照組OD值]×100%。

1.3.7 RT-qPCR技術檢測含藥血清對人胚肺成纖維細胞中IL-17A含量的影響 用超純RNA提取試劑盒提取樣本中總RNA，具體操作按試劑盒說明進行。采用實時定量PCR方法檢測mRNA的相對表達水平，以GAPDH作為內參基因。引物序列見表1～2。

表1 IL-17A引物序列

表2 COL-Ⅰ引物序列

1.3.8 Western blot檢測COL-Ⅰ、IL-17A含量的變化 抽提總蛋白，具體操作按試劑盒說明進行。最后按照1∶1的比例將ECL發光液中的A液和B液混合，將膜正面朝上平放(避免氣泡)，均勻滴加顯色液，放入凝膠成像儀中顯影。

2 結果

2.1 最佳濃度含藥血清的選擇

2.1.1 各組含藥血清對人胚肺成纖維細胞的抑制情況 與對照組相比，隨含藥血清作用濃度的升高，對人胚肺成纖維細胞均有明顯的抑制作用，抑制程度逐漸增強，呈現劑量依賴性，當含藥血清的藥物濃度達0.0625倍(1/16)時，使細胞抑制率達到10.06%，該藥物劑量下，細胞抑制率較低，對人胚肺成纖維細胞損傷小，藥物濃度相對安全，可以考慮將含藥血清濃度稀釋16倍后的濃度定為該實驗的藥物最大無毒濃度，見圖1。

圖1 不同濃度含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖的抑制情況

2.1.2 Western blot法檢測不同藥物濃度作用后各組COL-Ⅰ 蛋白含量情況 人胚肺成纖維細胞加入含藥血清干預后，細胞內COL-Ⅰ蛋白含量比對照組明顯降低，且具有劑量依賴性，提示含藥血清有一定降解膠原蛋白的作用或者對細胞內膠原蛋白的沉積/降解過程有一定的調節作用，增強細胞的降解膠原蛋白的能力。組間分析顯示，最大無毒濃度組(a)降低最明顯，見圖2。

圖2 同濃度含藥血清對細胞內COL-Ⅰ蛋白含量的影響

2.2 含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖的影響 與A組比較，B組的人胚肺成纖維細胞增殖水平顯著增加(P<0.01)，增殖率為15.21%。與B組比較，C組和D組胞增殖水平降低(均P<0.01)，C組與D組之間細胞增殖率無明顯差異(P>0.05)；而E組細胞增殖水平與B組相似，兩組無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖的影響

2.3 實驗細胞形態觀察 與A相比，經TGF-β1誘導后的B組的人胚肺成纖維細胞增殖明顯提升，B組和E組的細胞形態由較大的梭形或不規則星形轉變成較為扁平的梭形結構。而C、D組與A組的細胞增殖及形態變化相似,見圖3。

圖3 實驗細胞形態觀察

2.4 各組人胚肺成纖維細胞中膠原蛋白COL-Ⅰ、IL-17A蛋白表達情況 TGF-β1處理組的膠原蛋白COL-Ⅰ蛋白表達量較空白組明顯增多，而含藥血清組的膠原蛋白COL-Ⅰ蛋白表達量較TGF-β1處理組明顯降低，見圖4。TGF-β1處理組的IL-17A蛋白表達量較空白組明顯增多，而含藥血清組及基因敲減組的COL-Ⅰ蛋白表達量較TGF-β1處理組及質粒過表達組明顯降低，見圖5。

圖4 各組溶液對人胚肺成纖維細胞內COL-Ⅰ蛋白表達量的影響

圖5 各組溶液對人胚肺成纖維細胞內IL-17A蛋白表達量的影響

2.5 各組人胚肺成纖維細胞中IL-7AmRNA的表達量 與A組人胚肺成纖維細胞中的IL-17AmRNA表達量相比，B組顯著升高(P<0.05)；與B組人胚肺成纖維細胞中的IL-17AmRNA表達量比較，C組明顯降低(P<0.05)；D組人胚肺成纖維細胞中的IL-17AmRNA表達量顯著低于B組(P<0.05)；E組人胚肺成纖維細胞IL-17AmRNA表達量顯著高于C組(P<0.05)，見表4。

表4 各組人胚肺成纖維細胞中IL-7AmRNA的表達量

3 討論

肺間質纖維化的形成與炎癥反應、氧化應激、細胞因子異常釋放、免疫系統失調、微循環障礙及細胞增殖、重構等有關，最終導致細胞外基質的過度沉積,其主要成分是由不溶性纖維蛋白組成[9]。因此，維持肺組織細胞穩態、降解膠原蛋白可能成為攻克IPF的關鍵之一。有研究發現阻斷IL-17A的活性，激活細胞自噬的發生，進一步阻止中晚期膠原蛋白的異常沉積[10]。因此，靶向調控IL-17A有可能成為肺纖維化的診療新靶點。

2010年,有研究[11]發現白介素17A型細胞因子(Interlukine-17A,IL-17A)可促進肺纖維化的發生,而敲除IL-17A的受體則可以改善由博萊霉素(Bleomycin,BLM)誘導的肺纖維化發生。IL-17A可通過TGF-β1依賴及TGF-β1非依賴兩種途徑誘導肺纖維化的發生。TGF-β1可促進膠原的轉錄,增加膠原的表達,IL-17A可激活TGF-β1促進膠原的表達。同時,IL-17A還可以通過非TGF-β1依賴途徑抑制由饑餓誘導的自噬活化,抑制經自噬-溶酶體途徑導致的膠原降解[12-15]。因此,調節IL-17A引起的免疫反應有可能成為治療肺纖維化疾病的潛在靶點。

本課題組在傳統中醫理論指導下，結合肺纖維化的臨床特征及病理變化、病程進展，應用李芮教授治療肺纖維化的經驗方 “補腎活血方”(人參、熟地黃、山茱萸、黃芪、麥冬、五味子、當歸、丹參、黃芩、川貝母、虎杖、炙甘草)進行了一系列的實驗研究。方中以人參、熟地黃為君，補氣益肺、滋補腎陰；山茱萸補益肝腎，黃芪、麥冬健脾補中、補益肺氣、養陰生津，五味子上斂肺氣、下滋腎陰，四者共為臣藥；佐以當歸、丹參活血行氣以化瘀毒，黃芩、川貝母清泄肺熱化痰、潤肺止咳以化痰毒，虎杖、炙甘草清熱解毒、化痰止咳以祛毒熱之邪；炙甘草兼為使藥，調和諸藥。中藥復方“補腎活血方”具有扶助正氣、化痰祛瘀、泄濁解毒之效，對正氣虧虛、水津不布、瘀毒壅塞引起的痰瘀毒聚具有明顯的改善作用，在間質纖維化的臨床應用中具有顯著的臨床療效[16-19]。

通過測定不同濃度含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖的抑制情況，最終選出含藥血清的最大無毒濃度。而人胚肺成纖維細胞加入含藥血清干預后，細胞內COL-Ⅰ蛋白含量表達比對照組明顯降低，且具有劑量依賴性，提示含藥血清有一定降解膠原蛋白的作用或者對細胞內膠原蛋白的沉積/降解過程有一定的調節作用，增強細胞的降解膠原蛋白的能力。組間分析結果提示，考慮選定含藥血清(1/16倍)濃度為該實驗的最佳有效濃度，即稀釋16倍的含藥血清濃度為該實驗的最佳有效濃度，后續實驗中含藥血清均應用該濃度進行。

B組人胚肺成纖維細胞的細胞增殖率明顯高于A組，且B組細胞中COL-Ⅰ的蛋白表達量明顯高于A組，與文獻報道基本一致，說明應用TGF-β1作用于人胚肺成纖維細胞造模成功。

與B組比較，C組和D組細胞增殖水平降低(均P<0.01)，C組與D組之間細胞增殖率無明顯差異(P>0.05)；而E組細胞增殖水平與B組相似，兩組之間無明顯差異(P>0.05)。同時與B組比較，C組和D組細胞中膠原蛋白COL-Ⅰ的蛋白表達量均明顯降低，而E組細胞中的膠原蛋白含量較C組明顯增多。這提示含藥血清能夠明顯降低人胚肺成纖維細胞中膠原蛋白的含量，其作用途徑可能與阻斷IL-17A通路有關。

在各組IL-17AmRNA表達量及IL-17A蛋白含量比較中發現，B組較A組IL-17AmRNA表達量及IL-17A蛋白含量明顯增多，而C組的表達量較B組明顯減少，且D組的表達量也較B組明顯減少(P<0.05)。E組與C組比較，明顯增多(P<0.05)。進一步印證補腎活血方治療肺纖維化通過阻斷IL-17A通路而實現。

在治療肺間質纖維化方面，臨床應用療效確切的補腎活血方主要是通過阻斷IL-17A通路、降解膠原蛋白而實現的。許多研究發現，阻斷IL-17A能夠抑制Vps34(Ⅲ型磷酸肌醇3-激酶，PI3K)，進而通過GSK3β信號通路激活抑制性蛋白Bcl-2的ser70位的磷酸化，抑制Bcl-2與Beclin-1結合，最終促進自噬活化，增加膠原蛋白的降解。LAMP-1是溶酶體的表面標志，通過檢測LC3+LAMP-1+ 自噬溶酶體，可評價自噬活性[20-23]。目前已在進一步完善該實驗，進行細胞的GSK3β信號通路及LC3自噬小體的實驗研究，因此補腎活血方具體通過阻斷IL-17A的哪條信號通路實現降解膠原蛋白，以及膠原蛋白如何進行降解，目前正在進行實驗進一步予以研究和驗證。

4 結論

補腎活血方能有效降解人胚肺成纖維細胞中膠原蛋白的含量，具有較強的降纖作用，且主要是通過阻斷IL-17A通路降解膠原蛋白而起到抗纖維化作用。