葛根芩連湯對脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠MAPK/NF-κB信號通路的調節(jié)及肺組織保護作用*

劉婷婷 雷華 董紅艷 王婷婷 王學武

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院干部保健科，新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院針灸推拿科，新疆 烏魯木齊 830054；3.昌吉州中醫(yī)醫(yī)院針灸科，新疆 昌吉 831100；4.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學部，新疆 烏魯木齊 830001；5.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830001)

急性肺損傷是由各種原因引起的肺組織細胞損傷，進而導致機體出現(xiàn)以低氧血癥和呼吸窘迫為主要臨床表現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病之一[1]。由于急性肺損傷具有發(fā)病率及病死率高的特點，且目前臨床上還沒有用于治療急性肺損傷的特效藥物[2]，故對于治療急性肺損傷藥物的研發(fā)仍是目前亟需解決的問題之一。MAPK/NF-κB信號通路是調節(jié)機體炎癥信號傳遞的重要信號轉導通路之一[3]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，MAPK/NF-κB信號通路與急性肺損傷的發(fā)病機制及疾病進展密切相關。葛根芩連湯是以中國傳統(tǒng)醫(yī)學理論為指導的中藥成方制劑，具有調節(jié)血糖、抗炎等多種藥理作用[6-7]，然而葛根芩連湯對急性肺損傷大鼠的藥理作用及機制，目前報道鮮少。本研究通過探討葛根芩連湯對急性肺損傷大鼠MAPK/NF-κB信號通路的調節(jié)作用及肺組織保護作用，旨在為葛根芩連湯的藥理作用研究提供理論基礎和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源 SPF級雄性SD大鼠75只，6周齡，體重180～200 g，購買并飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物房溫度保持在20～24℃，濕度為40%～70%。本研究遵循動物倫理要求，并經新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 實驗器材 EVOS XL Core倒置顯微鏡(賽默飛世爾科技有限公司)；H3021D高速冷凍離心機(上海知信實驗儀器技術有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；ChemiDoc XRS凝膠成像儀(伯樂生命醫(yī)學產品有限公司)；BX50/BX-FLA/DP70光學/熒光顯微鏡(奧林斯巴有限公司)，UniCel DxC 800 Synchron全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特商貿有限公司)；COULTER LH750全自動血細胞分析檢測儀購于美國 Beckman公司。

1.3 藥品與試劑 葛根芩連湯(由葛根、黃連、甘草、黃芩組成) 由藥材飲片分別制成每毫升含0.5、1.0、2.0 g生藥的制劑，購自北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司；脂多糖(批號：20190611)購自上海華藍化學科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號：P0012)、SOD活性檢測試劑盒(批號：S0101)，MDA檢測試劑盒(批號：S0131S)，TNF-α(批號：PT516)、IL-6(批號：PI328)、IL-1β(批號：PI303)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒，p- NF-κB/P65(批號：AN371)、NF-κB/P65(批號：AF1234)、P38/MAPK兔單克隆抗體(批號：AF1111)、p-P38/MAPK(批號：AF5887)及GAPDH(批號：AF1186)兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (批號：A0208)、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(批號：P0018M)、RNA提取試劑盒(批號：R0016)、cDNA反轉錄試劑盒(批號：D7160S)均購自碧云天生物科技有限公司。

1.4 急性肺損傷模型大鼠的建立 75只大鼠按照隨機數(shù)字表法完全隨機化，分為對照組、模型組、GQL低、中、高劑量組，15只/組。除對照組外，其余大鼠參照文獻方法[8-9]，按照10 mg/kg的劑量腹腔注射給予大鼠脂多糖(LPS)，建立急性肺損傷大鼠模型，GQL低、中、高劑量組按照2.5 mL/kg的劑量[10]分別灌胃給予大鼠生藥含量為0.5、1.0、2.0 g/mL的葛根芩連湯，對照組及模型組灌胃給予大鼠等量生理鹽水，所有組別給藥1次/d，連續(xù)給藥8周[10]。

1.5 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測 大鼠眼眶后靜脈叢取血至離心管中，4 ℃靜置4 h，于4℃，3500 rpm離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書方法測定各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.6 大鼠肺泡灌洗液PMN的測定 每組取6只大鼠，用2%戊巴比妥(25 mg/kg)麻醉后仰臥固定于操作臺，行氣管切開后插入氣管導管，將15 mL無菌生理鹽水分3次經導管注入，收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavage fluid，BALF)，BALF回收率大約85%～90%，吸取1 mL BALF利用全自動血細胞分析儀對BALF中中性粒細胞(PMN)進行計數(shù)。

1.7 大鼠肺組織濕干重比值 每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后分離肺組織，用濾紙擦干后進行稱重，記為肺濕重(W1)，然后將肺組織放入烘箱中，60℃烘干至恒重，記為肺干重(D1)，計算肺組織濕干重比值(W/D)。W/D=W1/D1×100%。

1.8 大鼠肺組織SOD活性及MDA水平的測定 大鼠處死后取肺組織，用4℃預冷的蒸餾水沖洗掉干凈，吸水紙吸干水分，按照試劑盒說明書檢測各組大鼠肺組織SOD活性及MDA水平。

1.9 大鼠肺組織病理學檢查 大鼠處死后分離肺組織，在10%中性甲醛中固定24 h，然后轉移至75%的酒精中，依次進行脫水、浸蠟、包埋，5 μm切片，然后經過脫蠟、復水、蘇木精染色、分化、伊紅染色等步驟進行常規(guī)蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色)，并在顯微鏡下進行組織病理學觀察。

1.10 實時定量PCR檢測大鼠肺組織NF-κB/P65及P38/MAPK mRNA水平 大鼠處死后迅速取肺組織，按照RNA提取試劑盒方法提取大鼠肺組織的總RNA，并將總RNA逆轉錄成cDNA，以GAPDH為內參，定量PCR檢測肺組織NF-κB/P65及P38/MAPK mRNA的表達。用于檢測實時定量PCR的各基因引物見表1，結果采用2-△△Ct法計算各基因相對表達量。

表1 用于PCR檢測的引物序列

1.11 Western blot檢測大鼠肺組織p- NF-κB/P65、NF-κB/P65、P38/MAPK、p- P38/MAPK蛋白水平 取各組大鼠肺組織，在玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液進行勻漿，以4℃，12000 rpm離心10 min，取上清液，加入上樣緩沖液，混勻后置于100℃水浴5 min變性。BCA法測定蛋白濃度后，取50 μg蛋白進行電泳分離，經轉膜、封閉液封閉后，經p- NF-κB/P65、NF-κB/P65、P38/MAPK、p- P38/MAPK及GAPDH抗體(1∶1000)4℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，PBST再次清洗3次，凝膠成像儀成像后，使用Image J v1.8.0軟件進行灰度值檢測及分析。

2 結果

2.1 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 模型組急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較對照組升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，葛根芩連湯各劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平

2.2 各組大鼠肺組織W/D及肺泡灌洗液PMN水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織W/D及肺泡灌洗液PMN水平顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，葛根芩連湯各劑量組大鼠肺組織W/D及肺泡灌洗液PMN水平顯著降低(均P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠肺組織W/D及肺泡灌洗液PMN水平

2.3 大鼠肺組織的SOD活性及MDA水平 模型組急性肺損傷大鼠肺組織SOD活性較對照組降低，MDA水平較對照組顯著升高(均P<0.05)；與模型組大鼠比較，葛根芩連湯各劑量組SOD活性升高，MDA水平降低(均P<0.05)，見表4。

表4 大鼠肺組織SOD活性及MDA水平

2.4 肺組織病理學檢查 對照組大鼠肺組織結構正常，未見明顯病理學變化；與對照組比較，模型組大鼠肺組織可見明顯炎性細胞浸潤及細胞壞死、脫落，肺泡間隔明顯變寬，提示造模成功；與模型組比較，葛根芩連湯各劑量組大鼠肺組織病理學明顯改善，炎性細胞浸潤明顯減輕，細胞壞死脫落數(shù)量明顯減少，肺組織細胞結構明顯恢復，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學檢查結果(HE, 400×)

2.5 各組大鼠肺組織NF-κB/P65及P38/MAPK mRNA水平 模型組大鼠肺組織NF-κB/P65及P38/MAPK mRNA水平較對照組升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根芩連湯各劑量組NF-κB/P65及P38/MAPK mRNA水平降低(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠肺組織NF-κB/P65及P38/MAPK mRNA水平

2.6 各組大鼠肺組織p-NF-κB/P65、NF-κB/P65、P38/MAPK、p-P38/MAPK水平比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織p-NF-κB/P65、NF-κB/P65、P38/MAPK、p-P38/MAPK水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，葛根芩連湯各劑量組大鼠肺組織p-NF-κB/P65、NF-κB/P65、P38/MAPK、p-P38/MAPK水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織p- NF-κB/P65、NF-κB/P65、P38/MAPK、p- P38/MAPK水平

3 討論

急性肺損傷是由多種因素引起肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞凋亡、脫落，引發(fā)肺組織發(fā)生彌漫性水腫等病理學改變，表現(xiàn)為急性低氧性呼吸功能不全等癥狀。急性肺損傷患者主要以進行性低氧血癥和呼吸窘迫，肺部影像學非均一性滲出性病變等為主要臨床表現(xiàn)。急性肺損傷若不及時干預，會進一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，還可累及心、腎等多種組織器官病變。目前臨床上對于急性肺損傷的治療還沒有確切的治療方案，主要以原發(fā)病治療及呼吸支持治療為主要手段[11]。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)參與細胞生長、凋亡等生理過程的信號轉導，并由細胞因子、神經遞質等因素，以及細胞應激及細胞黏附等生理過程激活[12-13]。NF-κB信號通路是控制細胞基因轉錄、細胞因子的產生和細胞存活的重要信號通路，并參與細胞對應激、細胞因子、自由基、重金屬、紫外線照射、氧化損傷等因素的刺激反應[14-15]。NF-κB信號通路的異常激活與腫瘤、感染性休克等多種疾病的發(fā)病機制密切相關。近年來研究表明[16-18]，MAPK/NF-κB信號通路與急性肺損傷的發(fā)病機制及疾病進展有關。何梅英[16]研究發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷大鼠體內NF-κB信號通路異常激活，抑制NF-κB等相關蛋白的過度表達則能夠明顯改善大鼠肺組織病理學變化；陳昱曉等[17]報道了急性肺損傷小鼠體內MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白均存在過度表達現(xiàn)象，MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白的表達降低則與肺損傷小鼠體內炎癥水平及肺組織病理學改善密切相關。

葛根芩連湯是由葛根、黃芩、黃連及甘草等中藥材組成的中藥成方制劑，記載于中國傳統(tǒng)醫(yī)學著作《傷寒論中》，具有解表清里之功效，主要用于呼吸系統(tǒng)感染及胃腸道疾病。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明[19]，葛根芩連湯對糖尿病腎病、牙周炎、心血管疾病等具有顯著作用，同時，葛根芩連湯在治療肺纖維化及小兒支氣管炎的臨床應用中也表現(xiàn)出顯著療效。近年來，有學者[20-21]發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯能夠通過調控MAPK/NF-κB信號通路及相關蛋白的表達，對糖尿病及潰瘍性結腸炎等疾病具有明顯的治療作用。

血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的升高提示體內存在一定程度的炎癥反應，其水平升高的程度反映炎癥的程度[22]。肺組織濕干重比值及肺泡灌洗液PMN水平升高提示肺組織存在炎癥水腫等病理學變化[23]， 肺組織SOD活性降低及MDA水平的升高也表明肺組織細胞存在一定程度的氧化應激損傷[24]。本研究通過采用腹腔注射LPS方法建立急性肺損傷大鼠模型，研究葛根芩連湯對大鼠肺組織保護作用及MAPK/NF-κB信號通路的調節(jié)作用。本研究結果表明，與模型組比較，葛根芩連湯各劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平、肺泡灌洗液PMN、肺組織濕干重比值及MDA水平均顯著降低，肺組織SOD活性顯著升高，大鼠肺組織病理學明顯改善，提示葛根芩連湯能夠明顯改善急性肺損傷大鼠的肺組織氧化應激損傷及機體炎癥狀態(tài)，改善肺損傷大鼠疾病進展及預后；同時，葛根芩連湯各劑量組大鼠肺組織NF-κB/P65及P38/MAPK mRNA水平、p- NF-κB/P65、NF-κB/P65、P38/MAPK、p- P38/MAPK蛋白水平顯著降低，提示葛根芩連湯對急性肺損傷大鼠的藥理作用機制可能與調節(jié)MAPK/NF-κB信號通路有關。但本實驗未能就葛根芩連湯對MAPK/NF-κB信號通路靶向調節(jié)作用及其上下游蛋白的反饋性調節(jié)作用進行研究，擬在今后的實驗中對上述問題做進一步討論。

4 結論

葛根芩連湯能夠通過降低炎癥因子水平，改善肺組織氧化應激損傷及病理學變化，進而發(fā)揮對急性肺損傷的保護作用，其機制可能與調節(jié)MAPK/NF-κB信號通路有關。