蜂毒肽通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/SMAD信號(hào)通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程*

阿布力米提·阿布來(lái)提 孫偉 阿迪力·薩來(lái) 孫曉宏 瓦熱斯江·衣不拉音 高云飛 初建虎 徐克明

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，新疆 烏魯木齊 830011)

肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一，腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的主要因素之一[1-2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)的異常高表達(dá)及其激活誘導(dǎo)腫瘤的EMT進(jìn)程是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要途徑[3-4]。蜂毒治療在我國(guó)歷史悠久，而蜂毒的主要有效成分是蜂毒肽。有研究表明蜂毒肽能夠抑制惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6]。但目前蜂毒肽在EMT進(jìn)程中的作用,如何影響TGF-β受體以及下游信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制尚不清楚。根據(jù)前期研究數(shù)據(jù)，TGF-β1可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，蜂毒肽處理可在一定程度上影響肺癌細(xì)胞緊密連接蛋白及骨架蛋白表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程，但具體作用機(jī)制及信號(hào)通路尚未明確。因此，本研究通過(guò)對(duì)TGF-β/SMAD信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及TGF-β受體Ⅰ/Ⅱ分布情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，旨在探討蜂毒肽在肺腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的抑制作用，并為蜂毒的開(kāi)發(fā)和推廣提供基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American type culture collection，ATCC)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(Gibco公司)；TGF-β1(Pepro Tech公司)；裂解液Trizol、RIPS裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒(Invitrogen公司)；細(xì)胞RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(Polymerase china reaction，PCR) 試劑盒(均TaKaRa公司)；兔抗鼠β-actin抗體、鼠抗人鈣黏附蛋白E、N-鈣黏蛋白、波形蛋白單克隆抗體、鼠抗人Smad2、p-Smad2單克隆抗體以及TGF-βI、TGF-βⅡ單克隆抗體(Abcam公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(control組)、TGF-β1組(TGF-β1組)、蜂毒肽組(Melittin，MEL組)及蜂毒肽+TGF-β1組(MEL+TGF-β1組)。TGF-β1組細(xì)胞加入2 μg/L TGF-β1，蜂毒肽組細(xì)胞加入2.5 mg/L蜂毒肽，蜂毒肽+TGF-β1組細(xì)胞加入2 μg/L TGF-β1+2.5 mg/L蜂毒肽，對(duì)照組細(xì)胞加入等量生理鹽水。常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞總RNA提取按照RNAprep Pure Micro Kit說(shuō)明操作，細(xì)胞總RNA采用Trizol法，用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序：95℃ 10s，95℃ 5s，60℃ 20s，40個(gè)循環(huán)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用相對(duì)定量分析按照2-[△△Ct(實(shí)驗(yàn)組)-△△CT(對(duì)照組)]求出鈣黏附蛋白E、N-鈣黏蛋白、波形蛋白mRNA表達(dá)水平。相關(guān)引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。基因引物見(jiàn)表1。

表1 4種基因上游和下游引物

1.3.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次后，加入適量混勻的細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，置冰上裂解30 min，收集細(xì)胞置于4℃、12 000 r/min離心15 min，離心半徑13.5 cm，吸取上清液，-80℃保存。使用 Bicinchoninic acid 蛋白(BCA 蛋白)定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。各組以 30～60 μg 相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodcyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。電泳完成后，使用半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene fluoride，PVDF)，然后用 5%脫脂牛奶封閉 1 h，隨后用1%脫脂牛奶稀釋一抗，4℃ 孵育過(guò)夜。次日使用Tris-HCl緩沖鹽溶液(Tris buffered saline tween，TBST)洗脫一抗，再 37℃ 孵育二抗1 h，采用化學(xué)發(fā)光劑顯影。觀察各組細(xì)胞鈣黏附蛋白E、N-鈣黏蛋白、波形蛋白及Smad2、p-Smad2蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于24孔板中，按對(duì)照組和蜂毒肽組分組處理后，常規(guī)培養(yǎng)12 h。采用冰甲醇固定10 min，5% Triton處理3 min，PBS洗滌3次。給予1%牛血清白蛋白(Bovine albumin，BSA)封閉30 min，加入TGF-βⅡ受體一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，加入標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h。于激光光共聚焦顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞TGF-βⅡ受體表達(dá)及分布情況。

1.3.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成5×105個(gè)/mL無(wú)血清細(xì)胞懸液，向每個(gè)Transwell小室中加入200 μl細(xì)胞懸液，并在24孔板每孔對(duì)應(yīng)加入600 μl的完全培養(yǎng)基，將小室放入孔中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進(jìn)行固定及染色。計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔移到濾膜下層的細(xì)胞總數(shù)，共計(jì)數(shù)中央及四周各5個(gè)視野并取其平均值。

1.3.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)8 g/L的Matrigel膠進(jìn)行水化，取50 μl包被于Transwell小室底部，37℃靜置2 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成1×106個(gè)/mL無(wú)血清細(xì)胞懸液，向每個(gè)鋪膠的Transwell小室中加入200 μl細(xì)胞懸液，并在24孔板每孔對(duì)應(yīng)加入600 μl的完全培養(yǎng)基，然后將小室放入孔中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)胞固定及染色。計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔移到濾膜下層的細(xì)胞總數(shù)，共計(jì)數(shù)中央及四周各5個(gè)視野并取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白mRNA表達(dá)情況的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β1組細(xì)胞鈣黏附蛋白E mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，TGF-β1組細(xì)胞N-鈣黏蛋白、波形蛋白mRNA表達(dá)水平則明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)。采用蜂毒肽干預(yù)后，蜂毒肽+ TGF-β1組細(xì)胞鈣黏附蛋白E mRNA表達(dá)水平明顯高于TGF-β1組細(xì)胞，且蜂毒肽+ TGF-β1組細(xì)胞N-鈣黏蛋白、波形蛋白 mRNA表達(dá)水平明顯低于TGF-β1組(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白鈣黏附蛋白E、N-鈣黏蛋白、波形蛋白mRNA表達(dá)情況的影響

2.2 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)情況的影響 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1組細(xì)胞中鈣黏附蛋白E蛋白表達(dá)水平明顯降低，其N-鈣黏蛋白、波形蛋白蛋白表達(dá)水平則明顯增高(均P<0.05)。蜂毒肽+TGF-β1組細(xì)胞中鈣黏附蛋白E蛋白表達(dá)水平明顯高于TGF-β1組，而N-鈣黏蛋白、波形蛋白明顯低于TGF-β1組水平(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白鈣黏附蛋白E、N-鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)情況的影響

2.3 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中TGF-βⅡ受體表達(dá)情況的影響 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中TGF-βⅡ受體表達(dá)量明顯優(yōu)于蜂毒肽組細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

圖3 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中TGF-βⅡ受體表達(dá)情況的影響

2.4 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中Smad2、p- Smad2 蛋白表達(dá)情況的影響 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Smad2在各組細(xì)胞中均存在陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組和蜂毒肽組中，p-Smad2基本不表達(dá)，加入TGF-β1刺激后，TGF-β1組中p-Smad2表達(dá)水平明顯增加，TGF-β1+蜂毒肽組中p-Smad2表達(dá)水平與TGF-β1組相比，明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中Smad2、p-Smad2 蛋白表達(dá)情況的影響

2.5 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞遷移能力的影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，蜂毒肽組細(xì)胞遷移能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TGF-β1組細(xì)胞遷移優(yōu)勢(shì)明顯(P<0.05)。加入蜂毒肽干預(yù)后，與TGF-β1組比較，蜂毒肽+TGF-β1組細(xì)胞遷移能力減小(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，40×)

2.6 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蜂毒肽組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TGF-β1組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力比較，優(yōu)勢(shì)明顯(P<0.05)。蜂毒肽+TGF-β1組細(xì)胞與TGF-β1組細(xì)胞比較，其侵襲能力明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，40×)

3 討論

EMT主要發(fā)生在上皮來(lái)源腫瘤的早期轉(zhuǎn)移，不僅影響細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)變化，對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)行為能力也有一定影響[7-8]。EMT的發(fā)生是多種信號(hào)通路共同作用的結(jié)果，探討不同信號(hào)通路間的相互作用關(guān)系，對(duì)于明確發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床用藥具有積極意義。

有研究顯示，TGF-β/SMAD信號(hào)通路參與TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生過(guò)程[9-10]。TGF-β屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族成員，是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的經(jīng)典信號(hào)通路之一，其可與細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[11-12]。既往文獻(xiàn)指出，TGF-β在癌癥發(fā)病早期對(duì)上皮細(xì)胞的異常增殖具有一定的抑制作用，但隨著腫瘤發(fā)病過(guò)程的進(jìn)展，在腫瘤發(fā)病晚期，TGF-β則扮演著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的角色，提示TGF-β在腫瘤的發(fā)病過(guò)程中具有重要地位[13-14]。在經(jīng)典的TGF-β/SMAD信號(hào)通路中，被激活的TGF-β可通過(guò)與細(xì)胞膜上的TGF-βRⅡ直接結(jié)合，可形成復(fù)合體，介導(dǎo)TGF-βRⅡ磷酸化反應(yīng)，從而與TGF-βRⅠ發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而激活TGF-βRⅡ相關(guān)的絲/蘇氨酸酶活性，刺激其信號(hào)通路下游Smad家族蛋白的活化[15-16]。Smad蛋白是由Smad基因編碼的小分子蛋白，是TGF-β受體復(fù)合物下游的調(diào)節(jié)蛋白之一，可介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)由細(xì)胞膜向細(xì)胞核的傳遞。Smad家族蛋白活化后可作為TGF-β受體復(fù)合物的底物，可促進(jìn)活化的Smad2、Smad3蛋白與Smad4相互作用，發(fā)生結(jié)合，形成Smad2/3-Smad4異聚體復(fù)合物并轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，從而參與細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控[17-18]。

為了解蜂毒肽在非小細(xì)胞肺癌TGF-β/SMAD信號(hào)通路中的作用極其具體機(jī)制，本研究將A549細(xì)胞分成4個(gè)組，即對(duì)照組、TGF-β1組、蜂毒肽組、TGF-β1+蜂毒肽組。免疫印跡實(shí)驗(yàn)及RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞鈣黏附蛋白E mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低，其N-鈣黏蛋白、波形蛋白 mRNA及蛋白表達(dá)水平則明顯升高(均P<0.05)，蜂毒肽+TGF-β1組細(xì)胞鈣黏附蛋白E mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯優(yōu)于TGF-β1組(P<0.05)，提示蜂毒肽可改變上皮樣特征蛋白及間質(zhì)樣特征蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯優(yōu)于對(duì)照組，蜂毒肽+TGF-β1組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯小于TGF-β1組細(xì)胞(均P<0.05)，提示蜂毒肽對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程中的肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移及侵襲能力具有一定影響。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Smad2在各組細(xì)胞中均存在陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組和蜂毒肽組中p-Smad2基本不表達(dá)，TGF-β1組細(xì)胞中p-Smad2表達(dá)水平明顯較對(duì)照組高，TGF-β1+蜂毒肽組中p-Smad2表達(dá)水平明顯較TGF- β1組降低(均P<0.05)，提示TGF-β1刺激可上調(diào)腫瘤細(xì)胞中p-Smad2表達(dá)水平，即TGF-β1可刺激腫瘤細(xì)胞中Smad2的磷酸化，與既往研究結(jié)果一致。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，加入蜂毒肽處理后，TGF-β1+蜂毒肽組中p-Smad2表達(dá)水平明顯較TGF-β1組降低(P<0.05)，提示蜂毒肽可抑制Smad2的磷酸化反應(yīng)，由此可進(jìn)一步影響細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，影響EMT進(jìn)程。

通常情況下，TGF-β相關(guān)信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)有賴于TGF-βRⅠ與TGF-βRⅡ的共同存在[19]。TGF-βR是TGF-β細(xì)胞膜表面具有高親和力的結(jié)合蛋白，其中TGF-βRI與TGF-βRTGF-βRⅡ同屬于絲氨酸和蘇氨酸激酶受體家族成員，均為跨膜蛋白，在機(jī)體細(xì)胞中廣泛表達(dá)；TGF-βRⅢ作為廣泛分布在細(xì)胞膜表面的大分子跨膜蛋白，主要發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)激酶底物的作用[20-22]。TGF-β首先與TGF-βRⅡ結(jié)合，TGF-β的構(gòu)像會(huì)發(fā)生改變,從而易被TGF-βRⅠ識(shí)別而形成TGF-βⅡ/TGF-β/TGF-βRI復(fù)合物，TGF-βRⅡ可通過(guò)磷酸化激活TGF-βRⅠ上的GS區(qū)，TGF-βRⅠ的磷酸化是信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵步驟，活化的TGF-βRI進(jìn)而可特異性的識(shí)別和磷酸化信號(hào)通路上受體調(diào)節(jié)性的Smad蛋白[23-25]。為了解蜂毒肽在此過(guò)程的作用，本研究將肺癌細(xì)胞A549分為對(duì)照組和蜂毒肽組，蜂毒肽組給予2.5 mg/L蜂毒肽干預(yù)12 h后，采用免疫熒光染色處理后，分布觀察兩組細(xì)胞中TGF-βⅡ含量及分布情況的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和蜂毒肽組細(xì)胞中TGF-βⅡ表達(dá)存在明顯差異，蜂毒肽組細(xì)胞中TGF-βⅡ含量明顯少于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)，提示蜂毒肽可明顯改善A549細(xì)胞中TGF-βⅡ的表達(dá)及分布，可能與蜂毒肽引起的p-Smad2磷酸化及TGF-β/SMAD信號(hào)通路激活有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，蜂毒肽通過(guò)抑制TGF-β/SMAD信號(hào)通路作用，抑制Smad2磷酸化，下調(diào)TGF-βⅡ分布，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程。