miR-16-5p靶向PTEN/PI3K/AKT信號通路對非小細胞肺癌細胞活性和遷移能力的影響*

陳民彪 蔡仁中 黃明芳 黃修明 廖緒強

(海南省人民醫院·海南醫學院附屬海南醫院胸外科，海南 海口 570311)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，以非小細胞肺癌(Non-samll cell lung cancer，NSCLC)發病率最高，占肺癌發病率的80%以上[1-3]。目前，NSCLC的臨床治療主要以手術切除、化療、放療為主，但預后不理想[4-6]。MicroRNA(miRNA)是一類內源性表達的非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，能通過與靶基因相互作用調節基因表達，其失調涉及癌細胞的各個方面，包括細胞的生長、凋亡、增殖、遷移和侵襲等過程[7-8]。蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)是近年被發現的包括NSCLC在內的各種癌癥類型中眾所周知的腫瘤抑制因子，通過介導磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(Protein kinase B, AKT)信號通路的活化，與癌癥進展密切相關[9]。miR-16-5p在NSCLC中低表達，其被認為是NSCLC的抑癌基因。因此，本研究旨在探討NSCLC中低表達的miR-16-5p對A549細胞活性、遷移和PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要材料 人源性NSCLC A549細胞株購自中科院上海細胞庫；TRIzol和LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司(美國)；AS-miR-16-5p及miR-NC序列的設計合成委托上海康成生物工程有限公司(中國)；含雙抗的RPMI 1640培養基購自Invitrogen公司(美國)；胎牛血清購自Hyclone公司(美國)；MTT試劑購自Sigma公司(美國)；Transwell小室購自Millipore公司(美國)；PTEN抗體、p-AKT抗體PI3K抗體購自Invitrogen公司(美國)。

1.2 細胞培養 A549細胞培養于含10%胎牛血清RPMI 1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱內培養并進行傳代。取傳代后對數期細胞用于后續實驗。

1.3 細胞轉染 收集A549細胞接種于6孔板中，分為Blank組、miR-NC組和AS-miR-16-5p組。根據LipofectamineTM2000說明書，在無血清RPMI 1640培養基中轉染miR-NC和AS-miR-16-5p質粒。在轉染6 h后，培養基替換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養48 h。收獲細胞用于qRT-PCR分析。

1.4 qRT-PCR檢測 TRIzol試劑提取細胞mRNA，根據反轉錄試劑盒步驟合成cDNA，然后擴增目的基因，檢測miR-16-5p表達水平。

1.5 MTT檢測 將每組A549細胞以每孔2×104個細胞接種在96孔板，置于37 ℃培養箱中分別培養至24、48、72、96 h，然后小心棄掉上清液。每孔中加入20 μL MTT溶液，并在培養箱中孵育4～6 h，然后小心棄掉上清液。每孔中加入150 μL DMSO溶液，避光震蕩10 min，通過酶標儀測定A549細胞在570 nm波長時的吸光度(OD值)。

1.6 細胞劃痕實驗 將每組A549細胞接種于6孔板，待細胞融合度達到90%時，使用無菌移液器在細胞上進行垂直刮擦，然后將培養板用PBS洗滌2次，然后加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養24 h后拍照。

1.7 Transwell實驗 將每組A549細胞接種于24孔板中Transwell上室中，將500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基加入下室中，37℃培養箱中培養細胞24 h。4%多聚甲醛固定后去除上室細胞，用0.1%結晶紫染色，通過酶標儀測定A549細胞在570 nm波長時的吸光度(OD值)。

1.8 蛋白質印跡法 收集每組A549細胞并用PBS洗滌3次。RIPA裂解緩沖液提取細胞的總蛋白，并通過BCA法進行蛋白定量。對總蛋白(25 μg蛋白/泳道)進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。將膜與一抗在4℃孵育過夜，然后與二抗在室溫孵育1 h。使用ECL發光劑顯影并通過軟件進行定量。

2 結果

2.1 AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞miR-16-5p表達水平的影響 與Blank組、miR-NC組相比，AS-miR-16-5p組miR-16-5p表達水平下降(P<0.05)；Blank組與miR-NC組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；表明AS-miR-16-5p抑制miR-16-5p在NSCLC A549細胞的表達，見圖1。

圖1 AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞miR-16-5p表達水平的影響

2.2 AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞活性的影響 與Blank組、miR-NC組比較，AS-miR-16-5p組細胞活性降低(P<0.05)；Blank組與miR-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；表明AS-miR-16-5p顯著抑制NSCLC A549細胞的活性，見圖2。

圖2 AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞活性的影響

2.3 AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，經處理24 h后，AS-miR-16-5p組較同期Blank組和miR-NC組細胞愈合率降低(P<0.05)，見圖3。此外，Transwell實驗結果顯示，AS-miR-16-5p組較同期Blank組和miR-NC組細胞遷移能力降低(P<0.05)，表明AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞的遷移能力具有明顯的抑制作用，見圖4。

圖3 AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞愈合率的影響

圖4 AS-miR-16-5p對NSCLC A549細胞遷移能力的影響(×200)

2.4 AS-miR-16-5p對PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達的影響 與miR-NC組和Blank組相比，AS-miR-16-5p組PTEN蛋白表達顯著升高(P<0.05)；相反，PI3K和p-AKT蛋白表達顯著下降(P<0.05)；表明AS-miR-16-5p調節PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達，見圖5。

圖5 AS-miR-16-5p對PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達的影響

3 討論

NSCLC是一種常見的呼吸系統惡性腫瘤，其發病率和死亡率逐年增加，占肺癌的總發病率80%左右[10-11]。miRNA是由19-24個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，與靶標mRNA的5′-URT或3′-UTR互補位點結合以調節靶標基因的表達，并進一步抑制翻譯和降解靶標基因。目前發現的miRNAs達1000余種，在癌癥的疾病進程中呈現高表達或低表達，發揮癌基因或抑癌基因的作用。miR-16-5p是miRNA-16家族中的一個亞型，現已明確miR-16-5p是一種抑癌基因，在腫瘤的發生、發展過程中具有調節細胞增殖、遷移和侵襲的能力[12-14]。在這項研究中，發現轉染細胞中AS-miR-16-5p表達降低。靶向PTEN/PI3K/AKT信號通路的AS-miR-16-5p通過調節細胞活性和遷移對NSCLC具有抗癌作用，這可能為NSCLC的精確治療提供理論參考。

PTEN/PI3K/AKT通路參與細胞增殖、凋亡等多種生命活動[15-18]。PTEN為人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，是NSCLC中已知的預后標志物和腫瘤抑制因子，同時具有脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶活性[19]。PTEN的低表達或者失活能夠增強PI3K/AKT信號通路活化。PI3Ks家族包含在PI3K/AKT信號通路中，通過調節抗腫瘤藥物研究中的各種細胞過程，成為重要的腫瘤靶標[20-21]。有研究證實，在許多腫瘤中減少或不存在的抑癌基因PTEN具有雙重特異性磷酸酶活性，其脂質磷酸酶活性通過滅活PI3K/AKT信號通路來阻止生物過程，從而抑制腫瘤的發展[22]。也有文獻記載，PTEN的失活通過激活PI3K/AKT信號通路增強了NSCLC細胞的侵襲能力，PTEN表達的上調可以抑制NSCLC細胞增殖并促進細胞凋亡，說明在NSCLC細胞中PTEN通過負調節PI3K / Akt通路來發揮其抑癌作用，而PI3K/Akt通路在生長發育、增殖、凋亡、遷移、浸潤過程中發揮重要作用[23-25]。miR-16-5p已經被證實參與腫瘤細胞的遷移、侵襲和血管生成[26-28]。隨后也被證實通過靶向PTEN靶標來調節細胞周期蛋白和PI3K/AKT信號通路來促進惡性黑色素瘤進展。本研究通過轉染AS-miR-16-5p 48 h后A549細胞內miR-16-5p表達下調，又分別通過MTT實驗、劃痕實驗和Transwell實驗，證實AS-miR-16-5p能明顯抑制A549細胞的活性和遷移。并且發現，應用AS-miR-16-5p抑制miR-16-5p后，PTEN蛋白表達增高，證明miR-16-5p調控PTEN表達，進而影響其下游PI3K和AKT蛋白表達。

4 結論

AS-miR-16-5p能夠抑制NSCLC A549細胞活性和遷移。此外，AS-miR-16-5p通過負調控PTEN/PI3K/AKT信號通路有可能成為NSCLC新靶點之一。本研究為NSCLC的生物靶向治療提供了新的思路和依據。