基于β 2AR2/β arrestin2/NFκB通路的地佐辛對心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用及機制*

閆照虹 喻倩 李娟 張芳芳 劉偉娜

(空軍軍醫大學唐都醫院麻醉科，陜西 西安 710038)

急性心肌梗死(Acute mycardia infarctin，AMI)是冠狀動脈閉塞使血流中斷，導致部分心肌嚴重缺血而發生局部壞死。再灌注療法是治療AMI最重要的方法，但研究已證明心肌組織缺血一定時間后重新恢復血流，會誘發心肌損傷，導致繼發性心臟損害甚至死亡，這一過程稱為心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1-2]。盡管MIRI的確切原因尚不清楚，但研究認為炎癥反應是缺血后繼發再灌注心肌損傷的主要因素之一[3-4]。在血流恢復到梗塞區域后，大量炎癥細胞被募集到損傷部位進行組織修復。但心臟炎癥反應的持續發展會導致不良的心臟重塑，不可避免地導致心力衰竭[5]。目前臨床尚無有效的治療方案，由缺血再灌注引起的梗塞擴大占梗塞總數的25%～50%，因此迫切需要加強對心臟的保護[6]。地佐辛是一種新型強效的阿片類鎮痛藥，具有起效快、鎮痛作用強、成癮性低、不良反應少等優點[7]，已經在臨床上廣泛用于手術后、胃鏡檢查和致癌鎮痛[8-9]。地佐辛具有很好的抗炎鎮痛作用，對缺血再灌注損傷也有保護作用，可保護下肢缺血再灌注誘發的心肌損傷；此外許多研究證據表明，阿片類藥物具有抗心肌缺血/再灌注損傷的心臟保護作用[10-11]。以上研究提示，地佐辛可能對心肌缺血再灌注損傷也有保護作用，但相關報道鮮少。因此，本研究通過復制MIRI大鼠模型，旨在探討地佐辛對MIRI的影響及其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康SD雄性大鼠60只，體重(260～280)g，由北京維通利華動物中心提供，許可證號為SCXK(京)2016-0011，所有動物均嚴格按照動物飼養規則喂養，溫度為(24±2)℃，濕度為50%～60%，自由飲水和攝食。本研究遵循動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核、批準。

1.2 主要試劑 地佐辛注射液(揚子江藥業有限公司，國藥準字H20080329，生產批號：20130503，規格1 mL：5 mg)；原位缺口末端標記法(TdT-mediatedd UTP nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒購自武漢博士德生物公司；HE染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒(碧云天生物科技公司，批號分別為C0105、P0013B、P0012S)；肌酸激酶(Creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶MB(Creatine kinase isoenzyme MB，CKMB)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為A032-1、E006-11)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)(RA20035)、白細胞介素6(IL-6)(RA20607)ELISA檢測試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)(bs-0032R)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)(bs-0127M)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)(bs-0081R)、β2腎上腺素受體(β2AR)(bs-0947R)、β-抑制蛋白2(β-arrestin2)(bs-1332R)、核因子κB抑制蛋白α抗體(IκBα)(bs-1287R)、NF-κB p65(bs-23216R)、beta-Actin(bs-0061R)、山羊抗兔IgG(H+L)/HRP(bs-40295G-HRP)均購自北京博奧森生物技術有限公司；BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)；多功能酶標儀(iMark680，Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組與MIRI模型的制備 大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組(Sham組)，心肌缺血再灌注模型組(MIRI組)，地佐辛高、中、低劑量組(20、10、5 mg/kg)[11]，每組12只。地佐辛高、中、低劑量組大鼠在造模前30 min經股靜脈注射地佐辛20、10、5 mg/kg，Sham組和MIRI組給予等量生理鹽水，預處理完成后，采用手術結扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法復制大鼠MIRI模型[12]：各組大鼠于末次給藥后禁食不禁水12 h，腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，連接肢體心電圖電極和小動物呼吸機，心前區脫毛備皮，碘伏消毒，沿左側第3、4肋間切開皮膚，打開胸腔，剪開心包，暴露心臟，使用止血鉗將左心耳提起，以0號縫合線在左心耳下方2 mm(冠狀動脈左前降支)活結結扎，45 min后打開結扎線恢復血流行再灌注2 h。以缺血時心肌局部蒼白或發紺，心電圖ST段持續抬高，再灌注時心肌紅潤且ST段下降1/2為造模成功。Sham組不進行結扎，其余操作同上；手術時模型組大鼠死亡1只，再灌注時模型組、地佐辛低、中劑量組各死亡1只(在造模過程中部分大鼠死亡，但每組樣本數量是足夠的，在統計學上仍有統計意義，不影響研究結果)。

1.3.2 心功能檢測 再灌注2 h后，麻醉大鼠，檢測各組大鼠心率(Heart rate，HR)，并分離右側頸總動脈，將PE50聚乙烯動脈導管經右頸總動脈插入至左心室，固定后用生物機能實驗系統檢測并記錄左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末(Left ventricular end-diastolic pressure LVEDP)，評價心臟功能。

1.3.3 心肌酶及炎性指標檢測 心功能檢測完成后，腹主動脈取血，靜置后以3000 r/min離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書的操作檢測血清中CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平。

1.3.4 心肌組織病理學檢查 取血完成后快速摘取心臟，將大鼠左心室缺血區心肌組織分為兩部分，一部分液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存待測；另一部分心肌組織，4%的多聚甲醛溶液固定，4 ℃過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察左心室組織學變化。

1.3.5 心肌細胞凋亡檢測(TUNEL染色) 將1.3.4制備的心肌組織石蠟切塊，切4 μm切片。細胞凋亡檢測按TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，細胞核固縮、染色體凝集呈棕褐色者為凋亡細胞。在400倍光鏡下觀察心肌細胞凋亡情況，每張切片隨機選擇5個視野拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算細胞總數和凋亡細胞，取平均值，計算細胞凋亡指數。細胞凋亡指數(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%

1.3.6 心肌組織凋亡相關蛋白的檢測(免疫組織化學法) 將1.3.4制備的心肌組織石蠟切塊，切片。按照試劑盒說明書步驟操作，將切片放入煮沸的檸檬酸修復液做抗原修復，3% H2O2去離子水孵育10 min，滴加一抗Iba-1，4℃冰箱孵育過夜，二抗顯色，光學顯微鏡觀察心肌組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達。每張切片隨機選擇5個視野拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定陽性表達的平均光密度值(mean IOD)。

1.3.7 Western blot檢測 心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα、NF-κB p65蛋白表達取-80℃冰箱保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(30 μg/孔)，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應一抗(β2AR、β-arrestin1、IκBα、NF-κB p65 按照1∶1000比例進行稀釋、β-actin 1∶5000按比例進行稀釋)于4℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

2 結果

2.1 地佐辛對MIRI大鼠心臟功能的影響 與Sham組相比，MIRI組大鼠HR、LVSP顯著降低、LVEDP顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中、低劑量組大鼠HR、LVSP顯著升高、LVEDP顯著降低(P<0.05)，且地佐辛高劑量組效果優于地佐辛中、低劑量組，呈一定的劑量依賴性。見表1。

表1 地佐辛對MIRI大鼠心臟功能的影響

2.2 地佐辛對MIRI大鼠血清中CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平影響 與Sham組相比，MIRI組大鼠CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中、低劑量組大鼠CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性。見表2。

表2 地佐辛對MIRI大鼠血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平影響

2.3 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織病理學變化的影響 HE染色結果顯示，Sham組大鼠的心肌細胞形態規則、排列整齊、心肌纖維完整，未見心肌細胞水腫、壞死；與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌嚴重受損，染色疏松，細胞形態不規則、排列紊亂、局部肌纖維橫紋消失，可見心肌細胞水腫變性，大量炎性細胞浸潤；與MIRI組相比，地佐辛高、中劑量組大鼠心肌細胞水腫減輕，心肌纖維排列較為整齊，纖維斷裂和炎性細胞浸潤減少，且地佐辛高劑量組效果優于地佐辛中劑量組。見圖1。

圖1 大鼠心肌組織形態學改變(HE染色，200×)

2.4 地佐辛對MIRI大鼠心肌細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示，Sham組凋亡細胞數量較少，與Sham組相比，MIRI組大鼠的心肌細胞核呈深褐色，凋亡數量顯著增加，心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中、低劑量組大鼠凋亡細胞個數明顯減少，心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。見表3、圖2。

表3 地佐辛對MIRI大鼠心肌細胞凋亡的影響

圖2 大鼠心肌細胞凋亡情況(TUNEL)

2.5 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達的影響 免疫組化結果顯示，與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中劑量組大鼠Bcl-2蛋白表達明顯升高，Bax、Caspase-3蛋白表達明顯降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。見圖3、表4。

表4 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響

圖3 大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(IHC)

2.6 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα、NF-κB p65蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與Sham組相比，MIRI組大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達顯著降低，NF-κB p65蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，地佐辛高、中劑量組大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達明顯升高，NF-κB p65蛋白表達明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。見表5、圖4。

表5 地佐辛對MIRI大鼠心肌組織β2AR/β-arrestin2/NF-κB p65通路相關蛋白表達的影響

圖4 大鼠心肌組織β2AR/β-arrestin2//NF-κB p65通路相關蛋白的表達

3 討論

再灌注治療是指通過藥物溶栓，支架植入術，或切除血栓將血液灌注缺血區域。但研究顯示在急性缺血性心肌再灌注治療過程中，一些接受再灌注治療的患者可能會增加心肌細胞死亡和心肌梗塞面積。再灌注治療是導致心肌細胞死亡的重要因素[13-14]。血流突然恢復后，心肌細胞受復雜事件(如鈣超載，離子穩態損失和氧自由基產生)的影響，激活細胞內損傷級聯反應，從而導致凋亡發生[15-16]。目前尚無有效的治療方法，因此解決或減輕局部缺血和再灌注損傷仍然是一個挑戰。

地佐辛是一種對5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取具有抑制作用的新型阿片樣受體拮抗鎮痛藥，可以激動κ受體，部分激動δ受體，已經在臨床上用于超前鎮痛和手術后鎮痛，其鎮痛效果可在肌內或靜脈內注射后的10～90 min內達到峰值，鎮痛作用與嗎啡相似或稍高，精神依賴性及相關不良反應較少[17]，是一種應用前景廣闊的新型藥物。地佐辛具有很好的抗炎鎮痛作用，可顯著降低腹腔鏡手術患者血清炎性因子水平，還可抑制TLR4-NF-κB通路，降低神經病理性疼痛大鼠脊髓組織TNF-α、IL-6水平[18]，降低腦缺血再灌注引起的神經元凋亡[19]，改善缺血再灌注引起的多種遠端器官損傷，如肺、腎等。此外有研究發現，κ-和/或δ-阿片受體的激活可直接參與心肌保護[20]，同類阿片藥物對MIRI具有顯著的心肌保護作用，如嗎啡可抑制炎癥因子和氧化應激反應，降低血清CK、CK-MB、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)水平和心肌梗死面積，減少大鼠心肌細胞凋亡，減輕大鼠MIRI[21]。由此推測，地佐辛可能對心肌缺血再灌注損傷有保護作用。雖然地佐辛的研究較多，但在心肌缺血再灌注相關報道鮮少，因此在進行動物藥效試驗時，設置濃度梯度，目的是為了考察藥物的量效關系，為藥物的安全性和臨床用藥提供參考。本研究通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支復制MIRI模型，結果顯示隨著地佐辛濃度的增加，模型大鼠的血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平依次降低；纖維斷裂和炎性細胞浸潤情況依次減輕，并且凋亡相關蛋白Bcl-2的表達和Bcl-2/Bax比值依次升高，Bax、Caspase-3的表達依次降低，心肌細胞凋亡減少；這提示，地佐辛可呈劑量依賴性地抑制炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。

NF-κB是一種轉錄因子，與NF-κB/Rel蛋白家族中不同亞單位形成的二聚體，包括p65、RelB、c-Rel、p50和p52，其中最主要的是NF-κB p65，它的活化可將其從NF-κB抑制蛋白IκBα中快速釋放，進入細胞核，促進多種促炎細胞因子的表達；抑制NF-κB途徑，可減少缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡[22]。有研究發現β2AR激活程度對心功能有重要影響，交感神經對心功能的調控作用是通過激活心肌細胞上的β-AR實現的，β2AR可與去甲腎上腺素(NE)結合，調節心血管功能和行為特征；地佐辛可阻斷去甲腎上腺素轉運蛋白(NET)的作用，抑制神經元突觸前膜對NE的再攝取[23]。而且β2AR激動劑能在免疫和炎癥反應中抑制NF-κB活性[24]，但是這一過程要通過β-arrestin2發揮作用。β2AR的表達增加可通過上調β-arrestin2的表達，抑制IκBα的降解，穩定NF-κB/IκBα復合物，抑制NF-κB的活化，減少炎性因子的釋放[25]。Wen等[26]發現，β-arrestin2基因的敲除可顯著惡化缺血再灌注引起的肝損傷，β2AR激動劑可上調β-arrestin2的表達，然后通過抑制TLR4-NF-κB途徑減輕小鼠肝缺血再灌注誘導的細胞凋亡和肝臟炎癥。本研究采用Western blot進一步檢測心肌組織中β2AR、β-arrestin2、IκBα、NF-κB p65蛋白的表達，結果顯示MIRI模型組大鼠心肌組織中β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達顯著降低，NF-κB p65蛋白表達顯著升高，而經地佐辛干預的大鼠心肌組織β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表達明顯升高，NF-κB p65蛋白表達明顯降低；這提示地佐辛對MIRI大鼠的保護作用可能與上調β2AR、β-arrestin2、IκBα的表達，從而降低NF-κB p65表達有關。

4 結論與啟示

地佐辛可抑制炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，對MIRI大鼠具有保護作用；其作用機制可能與上調β2AR、β-arrestin2、IκBα的表達，降低NF-κB p65表達有關。因條件限制本研究僅從動物水平進行了探討，后續可考慮采用心肌細胞，從體外細胞水平進行深入研究；且可考慮干預β2AR/β-arrestin2/NF-κB p65通路從反面驗證本研究結果。