電針干預對LPS 誘導帕金森病小鼠黑質NADPH 氧化酶表達的影響

亢愷雯 尹發明 王 淵 袁 偉 魯 剛 白秋菊 王 強

1.陜西中醫藥大學第二臨床醫學院，陜西咸陽 712046；2.青島市中醫醫院康復科，山東青島 266000；3.陜西中醫藥大學針灸推拿學院，陜西咸陽 712046

帕金森病（Parkinson disease，PD）又稱為震顫麻痹，多好發于中老年人，其發病率隨著年齡增長逐年升高[1]。臨床發現PD 大部分為散發，約20%患者有家族遺傳史[2]。其典型臨床表現為肌肉強直、運動遲緩、震顫等運動系統癥狀，部分患者存在嗅覺障礙[3]。病理表現為黑質多巴胺能神經元大量丟失，紋狀體內多巴胺水平顯著降低[4]。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）是小膠質細胞激活后產生的氧化酶。胞質內的亞基p47phox 轉移至細胞膜與p22phox 共同產生損傷神經元的超氧自由基O2-[5-6]。LPS 來源于細胞壁，可激活小膠質細胞分泌炎癥因子損傷黑質多巴胺神經元[7]。本研究擬通過經鼻滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）構建小鼠PD 模型，觀察“嗅三針”對PD 小鼠黑質區NADPH 氧化酶亞基p22phox 及p47phox 蛋白表達的影響，探究“嗅三針”對PD 小鼠的抗氧化應激作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取40 只6～8 周清潔級成年健康雄性質量22～25 g 的C57BL/6 小鼠，恒溫22℃，濕度40%～70%，適應性喂養1 周。動物由西安交通大學實驗動物中心提供，實驗使用許可證號：SYXK（陜）2018-001，動物生產許可證號：SCXK（陜）2020-001。對動物處理遵循2006 年國家科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定[8]。

1.2 試劑與儀器

LPS（美國Sigma 公司，批號：SV30010）；芐絲肼（美國Sigma 公司，批號：FSP100）；左旋多巴（美國Sigma 公司，批號：GKT137831）；抗p47phox 抗體兔來源多克隆（英國abcam，批號：ab166930）；抗p22phox抗體兔來源多克隆（英國abcam，貨號：ab75941）；SABC（兔IgG）免疫組織化學試劑盒（英國abcam，批號：SA1022）；DAB 顯色劑（biosharp，貨號：AR1022）；BA200Digital 數碼三目攝像顯微攝像系統；組織切片機（德國Leica 公司）；SDZ-Ⅱ型電針儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；小動物呼吸機（瑞沃德R407）。

1.3 模型制備

按照隨機數字表法將40 只小鼠分為空白組、模型組、左旋多巴組、電針組，每組10 只，對除空白組外的小鼠進行造模。氣體乙醚麻醉小鼠后，提起頸部，將10 μl LPS（濃度：1 g/L，溶于0.9%氯化鈉溶液中）用移液槍緩慢滴加入鼻孔。每日1 次，共1 個月，出現PD體征視為造模成功。空白組滴入等量的0.9%氯化鈉溶液[9]。

1.4 干預方法

1.4.1 電針組 參照《實驗針灸學》進行穴位定位[10]，“印堂”穴：內眥連線中點上2 mm 處。“迎香”穴：鼻腔外側向上被毛分界處。迎香穴為斜刺，指向內上方約30°角，印堂穴為平刺，指向鼻根，進針均為3 mm。參數設置：疏密波，頻率為2 Hz/100 Hz；正極接印堂穴，負極接迎香穴（每側10 min，共20 min），電流強度為1 mA；電針干預與造模當日同步進行，每日1 次，5 d為1 個療程，療程間休息2 d，總共2 個療程。

1.4.2 左旋多巴組 每日定時腹腔注射0.2 ml 復方左旋多巴注射液（2.5 mg/kg 的芐絲肼與10 mg/kg 的左旋多巴共同溶解于0.9%氯化鈉溶液中），每日1 次，5 d為1 個療程，療程間休息2 d，總共2 個療程。

1.4.3 模型組及空白組 模型組與空白組進行與電針組和左旋多巴組相同程度的抓取，不對其固定及進行其他干預。

1.5 行為學檢測方法

自發交替行為（spontaneous alternation behavior，SAB）測試：采用Y-maze 裝置在黑暗環境中對小鼠進行自發交替行為的探索和空間記憶能力的評估。實驗前30 min 暗適應。將小鼠放入Y-maze 的任一臂中，閉合上方遮光擋板，觀察并記錄其活動情況。每只小鼠測試1 次，每次10 min，記錄其進入不同臂的順序，統計總進臂次數及正確率。

1.6 免疫組織化學檢測p22phox 及p47phox 蛋白的表達

4%多聚甲醛固定小鼠腦組織，包埋后以5 μm 厚度連續切片（黑質部分），烘干處理。脫蠟水化，放入檸檬酸抗原修復液中，中火15 min，PBS 清洗，封閉，孵育一抗：抗p22phox（濃度1∶100），抗p47phox（濃度1∶50），4℃過夜。室溫放置30 min 后PBS 沖洗，孵育二抗，PBS 沖洗，滴加SABC 1 h，加顯色劑DAB 在暗處避光顯色。沖洗后蘇木精復染1 min，脫水后透明封片，鏡下觀察陽性細胞數目并拍片。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠自發交替行為測試結果比較

與空白組比較，模型組總進臂次數及正確率均明顯減少（P ＜0.01）；與模型組比較，電針組總進臂次數增加，正確率提高（P ＜0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠黑質區p22phox 及p47phox 蛋白陽性細胞表達水平比較

與空白組比較，模型組黑質區p47phox、p22phox蛋白陽性細胞數均明顯增加（P ＜0.01）；與模型組比較，電針組中黑質區p47phox、p22phox 蛋白陽性細胞數均降低（P ＜0.05）。見圖2～3。

圖2 各組小鼠黑質中p47phox 蛋白表達比較

圖3 各組小鼠黑質中p22phox 蛋白表達比較

3 討論

NADPH 氧化酶的功能為傳遞細胞間信號、改善記憶，其胞膜含催化亞基p22phox，胞漿含調節蛋白p47phox 等[11-12]。激活時p47phox 磷酸化并結合p22phox導致胞質蛋白移位至胞膜形成酶活性復合物[13]，傳遞電子形成超氧化物并產生活性氧自由基（reactive oxyradical，ROS）[14]。本研究結果顯示p47phox、p22phox在LPS 誘導的PD 模型中表達增加，電針干預可減少關鍵性調節亞基表達。

PD 患者黑質細胞遭受氧化應激損傷[15]，氧化應激可促進致病蛋白質聚集，干擾自噬[16]。多巴胺代謝失衡可破壞體內氧化與抗氧化系統[17]，NADPH 復合物是細胞內ROS 產生的主要來源[18]。ROS 激活神經膠質細胞產生大量毒性物質，對神經元產生不可逆的損傷[19-21]。小膠質細胞增殖后介導的氧化應激損傷可導致PD 慢性炎癥[22-23]。在MPP+誘導的多巴胺能神經元中加入NADPH 非特異性抑制劑加拿大麻素，可減緩神經元損傷[24]。NADPH 氧化酶是潛在的PD干預靶點[25]，電針干預可能通過相似機制作用于PD進展。

中醫認為PD 歸于“顫證”“痙病”。迎香穴屬手陽明大腸經可治療嗅覺障礙；印堂穴屬督脈可醒腦開竅。本研究結果顯示，早期電針干預抑制了NADPH 氧化酶并減弱了氧化應激所帶來的損傷，改善了LPS 誘導小鼠的探索和空間記憶能力障礙，為“嗅三針”治療PD 增加新的理論依據及治療靶向。