食用木薯塊根及其制品中生氰糖苷檢測方法的建立與應用

王琴飛，林立銘，張振文，余厚美，徐 緩，羊賢月

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，國家薯類加工技術研發分中心， 海南海口 571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz，Cassava）為大戟科木薯屬多年生植物，與甘薯、馬鈴薯并稱世界三大薯類作物，是目前淀粉和生物能源生產的重要原料，也是全球約10億人口的主要糧食。木薯中存在亞麻苦苷（Linamarin）和百脈根苷（Lotaustralin）2種生氰糖苷（Cyanogenic Glycosides，CNGs）[1]，在蒸煮或加工過程中，亞麻苦苷酶會降解部分CNGs產生不穩定的丙酮氰醇，進而產生的氫氰酸（HCN）和醛、酮等小分子化合物，少部分CNGs會穩定的存在于木薯食品中，若加工后食品中CNGs殘留量較高，攝入人體內后，在β-葡糖糖苷酶的作用下會分解成HCN，容易引起呼吸中樞及血管運動中樞麻痹，甚至導致死亡[2]。在非洲和南美地區，長期食用CNGs高含量的木薯食品，會引發熱帶神經性共濟失調癥（TAN），在兒童和生育期婦女中還可能引發永久性下肢癱瘓癥（konzo）[1,3?5]。食用木薯塊根及其制品中CNGs的存在，給木薯“食用化”帶來不可忽視的安全隱患。因此，對其CNGs的準確定量是評價其安全性的重要方式。

研究者在探索CNGs檢測方法的過程中發現，木薯塊根和木薯食品在高水分條件下，由于細胞結構破壞或自身降解酶的存在，使得以HCN含量表示氰化物的測量結果偏低[4,6?8]。由此認為，穩定高效的提取方法是對氰化物準確定量的前提。隨著色譜檢測技術的發展，高效液相色譜分別配備示差檢測器（RI）[9?10]或蒸發光檢測器（ELSD）[11]，UPLC-MS/MS[12?13]都可直接對CNGs的含量進行定量分析。但其也有各自的不足之處，如RI的靈敏度較低，重復性較差，目前已較少應用，如 Sornyotha等[10]利用其純化木薯塊根中亞麻苦苷，亞麻苦苷回收率可達到91.5%以上，但其分離效果較差，需要進行薄層層析去除雜質以達到樣品的基線分離；UHPLC-MS/MS雖然靈敏度高，重復性好，能對多種CNGs同時定性定量分析，但樣品需要進行脫脂或固相萃取等前處理，儀器設備昂貴成本較高，對于方法的普及難度較大[12]；蒸發光散射檢測器（ELSD）作為一種新型的通用型檢測器，與液相色譜結合實現了重復性好、靈敏度高等優勢，在木薯、亞麻籽、苦杏仁等作物單一的CNGs的檢測中已廣泛應用[10?11,14]。如鄒良平等[11]通過甲醇溶液提取木薯葉片中亞麻苦苷，評價了不同木薯品種中亞麻苦苷含量的差異，但并未對方法的回收率進行驗證；周新城等[15]在其基礎上，用預熱的80%甲醇提取木薯中2種CNGs，但甲醇有毒，提取過程中試管易爆管，對操作人員安全難以保證，也會影響提取效果。前人研究結果證明，穩定高效的提取方法是CNGs準確定量的前提。

因此，本研究以食用木薯塊根及其制品為實驗材料，期望通過優化CNGs提取方法，建立HPLCELSD同時測定木薯塊根及其制品中2種CNGs的定量分析方法，以期為木薯及其制品中氰化物的安全評估提供檢測依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘華南9號’（SC9）、‘華南12號’（SC12）、‘華南6068’（SC6068）木薯新鮮塊根 2019年采收于國家木薯種質資源圃；亞麻苦苷（Linamarin, LI）、百脈根苷（Lotaustralin, LO）標準樣品 加拿大TRC公司（純度≥99.0%）；甲醇、乙腈 色譜純，美國Sigma公司；濃硫酸、甲酸等 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

采用Agilent1260型液相色譜系統：配備G1311C四元泵、G1329B自動進樣器、G4260B蒸發光檢測器和G1316A柱溫箱 美國安捷倫科技有限公司；Atlantic C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 美國Waters公司；Elix3+Synergy 超純水系統 美國Millipore公司；BSA124S萬分之一天平 美國Sartorius公司；PT1200E手提式組織勻漿機 瑞士KINEMATICA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木薯塊根的預處理及其食品制備

1.2.1.1 木薯新鮮塊根的處理 SC9、SC12和SC6068不同木薯品種塊根收獲后，用自來水清洗、瀝干表面水分，除去外表皮，分別把塊根的韌皮部（肉質皮層）和木質部（塊根實質）切成1 cm左右的顆粒，液氮速凍，保存于?40 ℃冰箱待用。

1.2.1.2 木薯粉的制備 2019年3月下旬種植的SC9、SC12和SC6068木薯品種，分別在木薯種植后塊根膨大期（6~7個月）、膨大期（7~8個月）、穩定期（8~9個月）和后熟期（9個月以上）四個時期采收新鮮塊根，參照張振文等[16]方法，剝去木薯新鮮塊根韌皮部，切絲、烘干、粉碎并過80目鋼篩，制備成木薯粉，常溫保存備用。

1.2.1.3 木薯粉食品的制備 利用1.2.1.2中制備好的 SC9品種木薯粉，參照《木薯及其食品加工技術》中的加工流程制備木薯餅干、木薯蛋糕、木薯面條、木薯饅頭和木薯年糕[17]，隨機取100.0 g制備好的木薯食品，放置于?20 ℃冰箱待用。

1.2.2 木薯新鮮塊根中CNGs的提取 稱取凍存的木薯新鮮塊根組織20.0 g，用勻漿機快速粉碎后，加入液氮，準確稱取冷凍的木薯新鮮塊根粉末1.00 g放入50 mL離心管中，按1:30的比例加入預冷（4~8 ℃）的0.025 mol/L硫酸溶液，在4 ℃條件下轉速10000 r/min離心10 min，收集上清液。取1 mL上清液用0.22 μm PTFE水系微孔濾膜過濾，用于高效液相色譜分析。每個樣品設置3個重復。

1.2.3 木薯粉及其食品中CNGs的提取 準確稱取0.200 g的木薯粉粉末和用勻漿機快速粉碎的木薯食品粉末，加入預冷（4~8 ℃）的0.100 mol/L硫酸溶液1.5 mL，在4 ℃條件下轉速10000 r/min 離心10 min，收集上清液。取1 mL上清液用0.22 μm PTFE水系微孔濾膜過濾，用于高效液相色譜分析。每個樣品設置3個重復。

1.2.4 ELSD檢測參數優化 根據儀器性能、流動相的種類和比例，參照文獻[18?19]方法，首先，設定氮氣氣流速度為1.6 L/min，用100 mg/L亞麻苦苷和百脈根苷混合標準溶液進樣，在80~100 ℃范圍內改變漂移管溫度，觀察基線水平和2種CNGs的峰面積變化，確定ELSD最佳的偏移管溫度；然后，固定優化的漂移管溫度，觀察1.6~2.4 L/min范圍內氮氣流速2種CNGs的峰面積變化，確定流動相揮發較好的最佳氣流速度；最后，設定1~9不同的檢測增益因子，觀察2種CNGs的峰面積變化和基線水平，確定同時檢測2種CNGs的最佳增益因子。

1.2.5 木薯中CNGs的檢測 參照文獻[9,12]方法并進行修改，利用液相色譜儀和1.2.4確定的ELSD檢測參數分析樣品中CNGs。色譜條件如下：Waters Atlantic C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫25 ℃，采用二元梯度洗脫，流動相A為含0.1%甲酸（V/V）的80%乙腈/水（V/V），B為0.1%（V/V）甲酸水溶液。起始時A為10%，B為90%，到15 min時，A和B都為50%；18 min時，A為100%，保持2 min；到22 min時A變化為10%，B%為90%；平衡柱子5 min，進下一個樣。流速0.6 mL/min；漂移管溫度95 ℃，霧化溫度80 ℃，氣流速度：2.0 L/min；增益為3；進樣量10 μL。

以外標法計算試樣中2種CNGs的含量。LI或LO含量（mg/kg）=CV/1000M。其中：C-標準曲線查得LI或LO的濃度，mg/L；V-樣品的提取液總體積，L；M-樣品質量，kg。

1.2.6 標準溶液的配制 分別精確稱取4.10和2.50 g的亞麻苦苷和百脈根苷，用色譜甲醇溶液溶解，配制成濃度為4100和2500 mg/L的標準儲備液，置于?20 ℃冰箱中保存備用。用0.025 mol/L的硫酸溶液稀釋亞麻苦苷和百脈根苷兩種標準儲備液，分別配置成4.1~820.0 mg/L和2.5~250.0 mg/L的5個梯度標準溶液，置于4~8 ℃冰箱中保存待用，用于方法線性關系的考察。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次，數據格式為平均值±標準誤。采用Microsoft Excel2013進行數據分析和制圖，采用SPSS22.0統計軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 木薯樣品中CNGs提取條件的優化

Bradbury等[20]研究結果表明，低濃度的HCl溶液可抑制亞麻苦苷酶活性，并且不同濃度的鹽酸對酶活性的抑制效果差異顯著。Sornyotha等[10]評價了不同種類的酸和不同酸濃度提取木薯塊根中亞麻苦苷提效果差異，認為采用0.25 mol/L硫酸溶液可有效提取木薯中亞麻仁苦苷的含量，提取率可達97%以上。而本實驗對不同濃度硫酸溶液提取CNGs效果比較發現：當硫酸濃度為0.010~0.050 mol/L時，木薯新鮮塊根中CNGs含量升高，但未達到顯著差異，并在提取溶液硫酸濃度為0.025 mol/L時，CNGs達到了最高含量630.07 mg/g（圖1A），隨后開始下降。木薯粉中CNGs含量隨著硫酸濃度的升高呈現先升后降的趨勢，當提取溶液硫酸濃度為0.100 mol/L時，CNGs達到了最高含量327.24 mg/g（圖1B）。證明不同硫酸溶液濃度適合不同的樣品形態中CNGs的提取，如0.025 mol/L硫酸溶液適合木薯新鮮塊根樣品CNGs的提取（圖2A），而0.100 mol/L硫酸溶液適合木薯粉樣品CNGs的提取，并且純水提取樣品（ck）中CNGs未檢測到（圖1B）。由此證明，樣品在水濕潤的條件下可以激活降解CNGs的相關酶，這驗證了Bradbury等[20]的研究結果，并推測不同樣品中降解CNGs的酶活性不同，需要不同濃度的硫酸以抑制其活性，而具體的抑制效率，需要進一步的實驗證明。因此，為了保證樣品中CNGs的穩定和有效提取，后續實驗分別選擇0.025和0.100 mol/L的硫酸溶液提取木薯新鮮塊根和木薯粉及食品中的CNGs。

圖1 硫酸濃度對食用木薯塊根（A）和木薯粉（B）中CNGs提取含量的影響Fig.1 Effect of different sulfuric acid concentration on the extraction of cyanogenic glycosides content in cassava root (A) and cassava flour (B)

圖2 HPLC-ELSD分析方法參數優化Fig.2 Parameter optimization of HPLC-ELSD analysis method

2.2 ELSD檢測參數優化條件的確定

根據漂移管溫度、氣流速度和增益因子優化，結果顯示：在80~100 ℃范圍內改變漂移管溫度，峰面積呈先升高后降低的趨勢，基線都較平穩，當漂移管溫度為95 ℃時，流動相基本揮發，峰面積最高（圖2a），確定漂移管溫度為95 ℃；通過1.6~2.4 L/min氮氣流速范圍，觀察2種CNGs的峰面積變化發現，峰面積在1.6~1.8 L/min氣流速度時快速下降，在2.0~2.5 L/min氣流時峰面積變化不明顯，并且基線噪音小（圖2b）。因此，為節約載氣，氣流速度選擇2.0 L/min。同時，因樣品中亞麻苦苷和百脈根苷的含量差異較大，調整不同的增益因子，峰面積隨著增益因子的增加而增加，但是基線噪音也開始增大，在增益為3時，樣品峰峰形較好，并能同時檢測2種CNGs（圖2c）。因此，ELSD參數選擇漂移管溫度為95 ℃，氮氣氣流速度為2.0 L/min，增益因子為3，采集樣品中的CNGs。

2.3 木薯樣品中CNGs的檢測

以優化的ELSD參數為檢測條件，對標準品和樣品中的亞麻苦苷和百脈根苷進行分析，結果顯示：標準品中2種CNGs在保留時間分別為5.8和8.6 min左右（圖3a、3A），樣品（木薯肉質皮層和木薯粉）中保留時間分別為5.8和8.6 min左右（圖3b、3B），保留時間基本一致。標準樣品和樣品中峰形較好，無拖尾現象。

圖3 標準樣品（a、A）和樣品（b、B）中CNGs高效液相色譜圖Fig.3 HPLC-ELSD chromatograms of cyanogenic glucosides in standards （a, A） and real samples （b,B）

2.4 HPLC-ELSD檢測方法的驗證

2.4.1 線性關系、檢出限考察 在1.2.5的色譜條件下，依次進樣10 μL，根據儀器性能和參照文獻[21]方法，以CNGs標準樣品濃度的自然對數（lgX）與ELSD測得的峰面積的自然對數（lgY）進行線性回歸分析，兩者間存在著良好的線性關系，亞麻苦苷和百脈根苷的線性相關性（r）達到了0.9996和0.9993（表1）。并分別以3倍和10倍信噪比確定兩種CNGs檢出限和定量限，亞麻苦苷和百脈根苷的檢出限分別為2.1和0.5 mg/kg，定量限分別為8.2和2.0 mg/kg。

表1 2種CNGs的線性范圍、相關性、檢出限和定量限Table 1 Linear range, correlation, detection limit and quantification limit of the two CNGs

2.4.2 儀器精密度試驗 以任意樣品連續進樣4次，每次進樣體積為10 μL，按照1.2.4色譜條件進行分離檢測，計算峰面積RSD，考察儀器的精密度。如表2所示，亞麻苦苷的峰面積分別為1372.0、1372.3、1368.9、1371.1 mV·s，RSD為0.1%，百脈根苷的峰面積分別為314.9、291.8、300.9、301.9 mV·s，RSD為3.1%，證明儀器精密度較好。

表2 儀器精密度試驗Table 2 The test of instrument precision

2.4.3 樣品穩定性試驗 取任意一樣品溶液，如表3所示，每隔4 h進樣1次測定峰面積，進樣后放置于4~8 ℃冰箱，計算24 h內樣品中亞麻苦苷和百脈根苷的含量變化，其亞麻苦苷含量分別為1192.7、1218.4、1241.1、1194.1、1272.1、1328.1 mg/kg，百脈根苷含量分別為300.9、280.4、291.2、303.1、273.5、298.2 mg/kg，亞麻苦苷和百脈根苷的含量變化的RSD分別為4.7%、4.6%，表明樣品在24 h內穩定性較好。

表3 樣品穩定性試驗Table 3 The test of sample stability

2.4.4 回收率試驗 取木薯肉質塊根和木薯粉樣品分別12份，每份樣品0.2000 g，分別取9個樣品加入不同的提取溶液，再分別按表4中加入量的濃度加入3個濃度梯度的亞麻苦苷和百脈根苷標準混合溶液；另外，以3份樣品不加入亞麻苦苷和百脈根苷標準樣品作為對照檢測本底量。所有樣品按照提取和檢測流程進行回收率試驗，每梯度設置3個重復。以回收率=（測得量?加入量）/加入量計算回收率。樣品回收率結果見表4所示：木薯塊根樣品中亞麻苦苷回收率在91.5%~96.3%之間，重復間RSD為2.6%，百脈根苷回收率在89.3%~95.4%之間，RSD為3.1%；木薯粉亞麻苦苷回收率在107.5%~114.9%之間，RSD為3.4%，百脈根苷回收率在108.6%~114.4%之間，重復間RSD為2.6%。樣品中亞麻苦苷和百脈根苷加標回收率較好，方法準確度較高，可用于實際樣品的測定。

表4 方法的回收率Table 4 Recovery test for the method

2.5 樣品驗證

2.5.1 不同品種木薯塊根中CNGs含量測定 研究表明[22]，木薯中CNGs主要以亞麻苦苷和百脈根苷兩種形式存在，分別占體內總量的95%~97%和3%~5%，不同的組織之間差異較大。通過樣品考察發現：木薯肉質皮層亞麻苦苷和百脈根苷含量分別在407.9~2221.1、100.6~222.5 mg/kg之間；肉質塊根亞麻苦苷和百脈根苷含量分別在106.5~713.8、0~46.6 mg/kg之間。3個木薯品種的塊根中CNGs同樣以亞麻苦苷為主，百脈根苷少量或檢測不到，并且塊根肉質皮層的CNGs含量遠遠高于肉質塊根（表5）。同時，不同品種木薯塊根CNGs的含量差異較大，亞麻苦苷高的木薯品種，百脈根苷含量同樣也高，這可能與不同品種中亞麻苦苷酶活性有關。驗證結果證明，建立的HPLC-ELSD方法可用于分析不同木薯品種中亞麻苦苷和百脈根苷。

表5 不同木薯品種肉質皮層和肉質塊根中CNGs含量Table 5 Cyanogenic glycosides contents in sweet cassava root cortex and root flesh of different varieties

2.5.2 不同采收時期木薯粉中CNGs含量測定 韓和悅[23]研究表明，木薯中CNGs含量受品種和采收時期的影響較大，木薯在進入成熟穩定期后，其CNGs含量相對較低，不同品種CNGs含量隨采收時間的時空變化趨勢也基本一致。由圖4可知，木薯粉中主要的CNGs為亞麻苦苷，含量是百脈根苷的10倍左右。考察的3個品種不同采收時期制備的木薯粉中2種CNGs變化規律基本一致，種植6~8個月的木薯制備的木薯粉中2種CNGs含量都先升高再降低；在種植8個月時CNGs的含量為最低；在種植9個月以后，其CNGs的含量再次升高。形成這一趨勢的原因可能是木薯種植8個月后，塊根已充分膨大，各項代謝處于穩定狀態，CNGs酶的活性也較低；而木薯塊根進入后熟階段后（9個月以上），木薯種植區氣溫開始下降，葉片開始脫落，塊根生長處于穩定狀態，CNGs穩定積累以抵御逆境[2,24]。SC9品種制備的木薯粉各個采收時期的CNGs含量相對較高，這與韓和悅的研究結果不同，這可能是由于不同的種植環境氣候差異所致。樣品驗證結果發現，CNGs含量高的品種，相同的加工工藝制備木薯粉，其CNGs含量也較高（表6、圖4）。因此，分析不同品種和不同采收時期木薯粉中CNGs含量變化，可作為提供木薯粉制作原料采收時期選擇的依據。

表6 木薯制品中CNGs含量及加工過程對產品的CNGS清除率Table 6 Content of CNGS in cassava products and the removal rate of CNGS in processed products

圖4 不同采收時期木薯粉中CNGs含量的變化Fig.4 Change of CNGs contents in cassava flour at different harvest times

2.5.3 木薯粉食品中CNGs含量測定 實驗分析了木薯粉加工為不同食品后CNGs含量變化。分析發現，木薯粉中存在2種CNGs，亞麻苦苷和百脈根苷含量分別為450.8、96.6 mg/kg；木薯粉加工的食品中僅檢測到亞麻苦苷，木薯餅干、木薯面條和木薯蛋糕中亞麻苦苷含量分別為199.2、151.8和99.5 mg/kg。并以木薯食品中CNGs清除率=（木薯粉CNGs總含量-木薯粉加工后CNGs總含量）/木薯粉CNGs總含量，分析了加工對木薯食品中CNGs清除率的影響，木薯餅干、蛋糕、面條、饅頭和年糕在加工過程中CNGs清除率分別為63.6%、72.3%、81.8%、100.0%和100.0%（表6）。有研究表明，通過剝去塊根肉質皮層，浸泡、晾曬、蒸煮、烘干、油炸等方式[4,25?28]，可以有效地清除食品中大部分氰化物，特別是木薯食品加工和食用過程中，剝去塊根肉質皮層可有效降低氰化物含量[26]。但不同的加工方式，其氰化物的清除率不同[29]。研究者認為，降低木薯及其制品中HCN含量需要從選擇好的品種，適時采收，充分加工，遵循良好生產操作規范出發[30]。本實驗結果也顯示，木薯粉在制作不同的食品過程中，不同的加工方式CNGs降解程度不同，證明選擇合適的加工方式，可以有效清除木薯食品中的CNGs。

3 結論

實驗通過提取液硫酸濃度的優化，確定了食用木薯塊根及木薯粉中CNGs提取的最佳提取濃度分別為0.025和0.100 mol/L，該提取方法簡單、安全、重復性好，可應用于木薯塊根及其制品中CNGs快速提取；通過色譜檢測參數的優化，建立了一種同時分析木薯塊根及其制品中亞麻苦苷和百脈根苷的HPLC-ELSD檢測方法，該方法重復性和穩定性較好，可應于木薯中CNGs種類和含量差異分析。樣品分析結果證明，木薯品種、生長期和加工方式對木薯新鮮塊根及其制品中CNGs含量的都有影響。該方法的建立，有助于育種工作者利用CNGs的含量對資源的分類、選擇和利用；有助于加工研究者根據品種、采收時期CNGs的含量差異，選擇合適加工工藝以降低其食品中CNGs含量，并為后期木薯食品的開發和食用安全評價提供理論參考。