猴頭菌液體發酵產多糖、核苷、萜類工藝優化及其抗氧化活性

萬寧威，雷幫星，何 勁, ，魏雨萌，譚川川

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550005；2.貴州大學貴州省生化工程中心，貴州貴陽 550025）

猴頭菌（Hericium erinaceus）是我國著名的藥食兩用真菌。猴頭菌隸屬真菌界擔子菌門猴頭菌科，廣泛用于治療胃潰瘍、慢性胃炎等疾病。猴頭菌味道鮮美、風味獨特、含有豐富的營養成分，包括蛋白質、脂肪、纖維素、多糖、微量元素及8種人體必需的氨基酸[1?3]。猴頭菌還具有多種功效與作用，猴頭菌多糖有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、提高免疫力等作用[4?6]，猴頭菌素等萜類物質具有抗氧化、抗菌、修復神經等功能[7?8]，核苷類物質有防止心率失常、降膽固醇、抗氧化等作用[9]。有研究證明，猴頭菌多糖、核苷、萜類物質具有清除ABTS+、DPPH等自由基活性，從而發揮其抗氧化作用[10?13]。目前，猴頭菌是以傳統的固體培養為主，但這種培養方式周期長、受環境影響大、產量低，不利于工廠化生產，而液體發酵培養可以在較短的時間內獲得大量菌絲體及富含活性成分的發酵液，具有生產周期短、易于控制發酵條件、產量高等多種優勢。目前，對猴頭菌液體發酵條件優化的評價指標還停留在生物量的大小，未深入到活性成分。

本文以多糖、核苷、總萜產量為指標，篩選最佳碳源、氮源，考察培養溫度、轉速、pH、接種量對猴頭菌液體發酵的影響，通過Box-Behnken試驗確定猴頭菌液體發酵的最佳工藝，并對發酵產物總的抗氧化活性進行評價，為猴頭菌液體發酵的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菌（Hericium erinaceus） 由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供；尿苷、腺苷、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（ DPPH） 大連美侖生物技術有限公司；鳥苷、齊墩果酸 成都曼思特生物科技有限公司；2，2'-聯氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） 梯希愛化成工業發展有限公司；基礎培養基：葡萄糖3%、酵母浸粉1.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、維生素B10.01%。

ZXY-48恒溫搖床 常州潤華電器有限公司；MHP-160霉菌培養箱 上海精其儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計、LC-20A型高效液相色譜儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器 日本島津公司；JM-LB50膠體磨 溫州強忠機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 猴頭菌液體種子的制備 用接種針刮取5塊約0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊接入基礎培養基中，25 ℃恒溫靜置24 h后，140 r/min、溫度25 ℃，搖床培養5~6 d。

1.2.2 猴頭菌液體發酵培養基組分及培養條件的確定

1.2.2.1 猴頭菌液體發酵培養基組分的篩選 調整基礎培養基碳源葡萄糖為玉米粉、土豆浸提液、乳糖、可溶性淀粉和復合碳源（玉米粉0.5%+可溶性淀粉2.5%），調整氮源酵母浸粉為蛋白胨、黃豆芽汁、山藥汁、黃豆粉、復合氮源（酵母浸粉1%+山藥浸提液5%），接種量10%（V/V），25 ℃，120 r/min培養8 d，考察發酵全液中多糖、總萜及核苷的產量。

1.2.2.2 單因素實驗確定猴頭菌液體發酵條件 以1.2.2.1篩選出的培養基為優化培養基，考察不同培養條件對發酵全液中多糖、總萜、核苷產量的影響，分別設置接種量6%、8%、10%、12%、14%，初始pH 4、5、6、7、8，培養溫度21、23、25、27、29 ℃，轉速100、110、120、130、140 r/min。單因素按變量取值時，接種量、初始pH、培養溫度、轉速固定值分別為10%、6、25 ℃、120 r/min，分析各因素的影響。

1.2.2.3 Box-Behnken試驗設計方案 在單因素實驗結果的基礎上，確定接種量、初始pH、培養溫度、轉速4個因素，結合響應面試驗研究各因素及其交互作用對猴頭菌液體發酵全液中多糖、總萜及核苷產量的影響，確定猴頭菌液體發酵的最佳工藝條件。設計試驗因素水平及編碼值見表1。

1.2.3 活性成分的測定

1.2.3.1 多糖 參照劉曉明等[14]方法，50 mL發酵全液加入5倍體積沸水浸提3 h，離心取上清液，減壓濃縮至25 mL，加入5倍體積無水乙醇4 ℃靜置過夜，抽濾，沉淀60 ℃干燥至恒重，得粗多糖備用，采用苯酚-硫酸法測定。

他走到了一個水坑旁邊。就在他彎下腰找鰷魚的時候，他猛然仰起頭，好像給戳了一下。他瞧見了自己反映在水里的臉。臉色之可怕，竟然使他一時恢復了知覺，感到震驚了。這個坑里有三條鰷魚，可是坑太大，不好舀；他用白鐵罐子去捉，試了幾次都不成，后來他就不再試了。他怕自己會由于極度虛弱，跌進去淹死。而且，也正是因為這一層，他才沒有跨上沿著沙洲并排漂去的木頭，讓河水帶著他走。

1.2.3.2 總萜 參照張琦等[15?16]方法，20 mL發酵全液加入5倍體積乙酸乙酯，超聲30 min（30 ℃，160 W），離心取上清液，減壓濃縮至10 mL備用，采用香草醛-濃硫酸法測定。

1.2.3.3 核苷 參照游靜等[17]方法，取發酵全液10 mL加入2倍體積甲醇，離心取上清液備用，采用高效液相色譜法測定，色譜條件為：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：純凈水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0~5 min，0→5%B；5~30 min，5%B；30~35 min，5→7.5%B；35~60 min，7.5→21.3%B）。

活性成分產量（mg/mL）=發酵全液活性成分含量（mg/mL）-空白培養基活性成分含量（mg/mL）。

1.2.4 菌絲體干重測定 取100 mL發酵液，蒸餾水洗滌3次，收集菌絲體，75 ℃烘干稱重。

1.2.5 抗氧化活性測定 參照薛山[18]方法，用蒸餾水分別將發酵全液、發酵液、菌絲體配制成質量濃度為500 mg/mL的混合液，均質備用。DPPH、ABTS自由基清除能力，總還原力測定方法參照何晉浙等[9]。

1.3數據處理

分別采用系統軟SPSS和Design-Expert 8.0.6進行顯著性和響應面分析。

2 結果與分析

2.1 培養基組分篩選

2.1.1 碳源的篩選 碳源對猴頭菌液體發酵全液中總萜、多糖、核苷產量的影響如表2所示，以復合碳源和可溶性淀粉為碳源的發酵全液中多糖產量最高，且與其他組差異顯著（P<0.05）。碳源對核苷產量影響顯著（P<0.05），其中復合組的核苷產量最高，土豆汁的核苷產量最低。復合組、乳糖、玉米粉的發酵全液中總萜產量最高。李衛衛等[19]發現玉米粉是促進猴頭菌菌絲體生長的良好碳源，且在培養基中添加一些速效碳源會更有利于其生長。本實驗將可溶性淀粉和玉米粉復配后發現復合組活性物質產量顯著優于其它組（P<0.05），可溶性淀粉和玉米粉的復合碳源為猴頭菌生長的最優碳源，可能是可溶性淀粉便于菌絲體吸收利用，玉米粉可為菌絲體的生長提供附著點，有利于菌絲體的生長和代謝產物的積累[19]。

表2 碳源對猴頭菌液體發酵的影響Table 2 Effects of carbon sources on liquid fermentation of Hericium ericium

2.1.2 氮源的篩選 不同氮源對猴頭菌液體發酵全液中總萜、多糖、核苷產量的影響如表3 所示。復合氮源組的多糖、總萜、核苷產量顯著高于其它組（P<0.05）。楊寧等[20]發現在猴頭菌培養基中加入山藥可促進菌絲體生長，但在本實驗中發現以山藥汁作為氮源，活性成分產量并不高，推測是山藥中氮源不能滿足猴頭菌前期生長，影響活性成分的合成。Cui等[21]發現酵母抽提物對猴頭菌菌絲體和胞外聚合物有顯著影響，最優條件下菌絲體生物量為21.47 g/L、胞外聚合物1.837 g/L，本實驗將山藥汁和酵母浸粉復配作為復合氮源，三種活性成分產量均顯著高于其他組（P<0.05），且菌絲體生物量為35.7 g/L，比Cui的研究提高了66.28%，可能是復合氮源中酵母浸粉為速效氮源，發酵前期可被快速吸收，山藥汁在提供氮源的基礎上還可提供Ca、Zn、Mg等生長因子[22]，促進猴頭菌的生長及代謝產物累積，綜上所述，選定山藥汁和酵母浸粉為氮源。

表3 氮源對猴頭菌液體發酵的影響Table 3 Effects of nitrogen sources on liquid fermentation of Hericium ericium

2.2 接種量對猴頭菌液體發酵全液中總萜、多糖和核苷的影響

如圖1所示，隨著接種量的增加，三種活性物質產量均顯著升高（P<0.05），當增加至8%時，總萜和核苷達到最高，后略微降低，推測原因是接種量大，菌絲生長點多，代謝產物多，但接種量過大，導致消耗營養物質速度加快，后期會抑制菌絲體生長及代謝產物累積。考慮生產成本，選擇8%接種量為最佳參數。

圖1 接種量對猴頭菌液體發酵的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on liquid fermentation of Hericium ericium

2.3 轉速對猴頭菌液體發酵全液中總萜、多糖和核苷的影響

轉速主要通過影響發酵環境中的溶氧量來控制猴頭菌發酵過程[23]。由圖2知，轉速對核苷產量并沒有顯著性影響（P>0.05）；多糖產量隨著轉速的增加而增加，在100~130 r/min無顯著性差異（P>0.05），轉速增至140 r/min時顯著降低（P<0.05）；總萜產量隨著轉速的增加呈現先增后降的趨勢，在120 r/min時達到最高，在轉速增至130 r/min時顯著降低（P<0.05），推測是由于轉速增加，溶氧量增大，菌絲體生長過快而消耗發酵液中多糖、萜類物質。綜上所述，最終選定最佳轉速為120 r/min。

圖2 轉速對猴頭菌液體發酵的影響Fig.2 Effect of rotation speed on liquid fermentation of Hericium ericium

2.4 初始pH對猴頭菌液體發酵全液中總萜、多糖和核苷的影響

如圖3所示，初始pH為5和6時，猴頭菌發酵全液中多糖、總萜、核苷產量較高，隨著pH的升高，活性物質的產量急劇降低，這是因為猴頭菌在中等酸度環境下才能分解培養基中的有機物質，過堿的環境會影響到菌絲體酶的活性，阻礙菌體的新陳代謝[24]。初始pH為6時，核苷產量顯著降低（P<0.05），有研究人員發現“酸脅迫”更有利于生物體內腺苷的積累，弱酸性條件下其生物合成關鍵酶的活性可以維持在較高水平[25]。綜上所述，選定初始pH為5。

圖3 初始 pH 對猴頭菌液體發酵的影響Fig.3 Effects of initial pH on the liquid fermentation of Hericium ericium

2.5 培養溫度對猴頭菌液體發酵全液中總萜、多糖和核苷的影響

溫度主要影響猴頭菌發酵進程中某些酶的活性[26]。猴頭菌液體發酵過程中多糖、總萜、核苷的產量隨溫度變化情況如圖4所示，三種活性物質產量隨溫度的升高先增加后減少，多糖在25 ℃時顯著高于其它溫度（P<0.05），核苷產量在23、25、27 ℃時差異性不顯著（P>0.05），Atila等[27]在探究溫度對猴頭菌生長發育的影響時發現，在25 ℃時，猴頭菌具有良好的生長潛力，推測是在25 ℃時，纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶等活性較高，可有效分解培養基中營養成分，促進活性物質合成。綜上所述，選定25 ℃為最佳溫度。

圖4 溫度對猴頭菌液體發酵的影響Fig.4 Effects of temperatures on liquid fermentation of Hericium ericium

2.6 響應面試驗

2.6.1 綜合評分計算 熵權法是一種確定指標權重的客觀賦權法，可確定多指標評價系統中各指標的權重。將各指標含量數據經歸一化處理[指標成分=（實驗值?最小值） /（最大值?最小值）]，消除指標之間量級和量綱的影響后，熵權法[28]計算得到多糖產量、總萜產量、核苷產量的權重值分別是 0.2925、0.3111、0.3964。按照M=多糖產量×0.2925+總萜產量×0.3111+核苷產量×0.3964，計算不同試驗號下各指標產量綜合評分。

2.6.2 響應面結果 Box-Behnken設計與結果見表4，利用Design-Expert 8.0.6進行分析和多元回歸擬合，建立以綜合評分為目標函數的二次回歸方程，并對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface experimental design and results

2.6.3 方差分析 綜合評分（M）與接種量（A）、轉速（B）、初始pH（C）和溫度（D）的二次多項回歸方程如下：

表5 方差分析顯示，該回歸模型極顯著（P<0.01），綜合評分與各個變量之間存在極顯著的線性相關，失擬性在置信區間95%水平上不顯著，方程失擬度較小，可利用該模型預測綜合評分與變量之間的關系。一次項C，交互項BC、BD影響極顯著（P<0.01）；交互項AD，平方項A2、B2影響顯著（P<0.05）。

表5 回歸方程方差分析及顯著性檢驗Table 5 Test of significance for regression equation coefficients of sensory evaluation

2.6.4 交互作用分析 根據回歸方程繪制等高線和響應面圖，由響應面圖可以直觀地反映兩因素間的交互作用，如圖5所示，在交互項對綜合評分的影響中，AB、AC和CD交互作用的響應面圖坡度較平緩，等高線較為松散，交互作用不顯著，與上述方差分析結果一致。當等高線為橢圓時表明交互作用較強，當等高線為圓形時則交互作用較弱[29]。由圖a知，沿D因素軸方向的較陡，沿因素A軸方向較為平緩，說明與接種量相比，溫度對三種活性物質產量影響更大，并且溫度與接種量間的交互作用較強。由圖b、c知，沿B、D因素軸方向較陡，則轉速和溫度對綜合評分的影響程度較強，轉速和pH對綜合評分的影響次之，底部等高線為橢圓且較為精密，表明轉速和pH間的交互作用顯著。

圖5 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖Fig.5 Response surface map of the influence of interaction of various factors on comprehensive score

2.6.5 最佳條件的驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件設計，得到綜合評分的預測值為2.164，此時工藝參數為接種量8.542%、轉速127.96 r/min、pH5.891、溫度23.477 ℃。考慮實際方便，調整模型最優發酵工藝參數為：接種量8.5%、轉速128 r/min、pH5.9、溫度23.5 ℃。采用此優化工藝對猴頭菌進行發酵，綜合評分為2.090，與預測值相對誤差為3.54%，在可接受的范圍內。說明利用響應面優化法得到的回歸模型發酵工藝參數能較準確地預測三種活性成分產量的綜合評分，其結果真實可靠，重現性高。

2.7 發酵產物抗氧化活性評價

發酵產物中萜類、多糖、核苷類物質具有抗氧化活性，通過測定其對ABTS+、DPPH自由基清除能力和總還原力，對發酵產物總的抗氧化活性進行評價。

2.7.1 對DPPH自由基清除能力 如圖6所示，發酵產物對DPPH自由基清除能力顯著高于空白培養基（P<0.05），隨著發酵全液、發酵液、菌絲體質量濃度的增加，各樣品對DPPH自由基的清除能力增強，其IC50值分別為166、237、53 mg/mL，菌絲體對DPPH自由基清除能力顯著高于發酵全液和發酵液（P<0.05），當菌絲體（濕）質量濃度為250 mg/mL時，清除率可達到90.06%±0.70%，趨近于質量濃度為10 μg/mL的維生素C溶液。

圖6 發酵全液、發酵液、菌絲體對DPPH·的清除率Fig.6 DPPH· scavenging rate of fermentation liquid,fermentation liquid and mycelium

2.7.2 對ABTS+自由基清除能力 如圖7所示，發酵全液、發酵液、菌絲體對ABTS+自由基清除能力顯著高于空白培養基（P<0.05），隨著質量濃度的增加，清除率增強趨勢一致，其IC50值分別為68、55、72 mg/mL。發酵液對ABTS+自由基清除率最高，可見胞外代謝產物對ABTS+自由基清除能力較強，在發酵液質量濃度為75 mg/mL時，清除率可達61.49%±0.30%，顯著高于發酵全液和菌絲體，低于維生素C（P<0.05）。

圖7 發酵全液、發酵液、菌絲體對ABTS+·的清除率Fig.7 ABTS+· scavenging rate of fermentation liquid,fermentation liquid and mycelium

2.7.3 總還原能力 如圖8所示，發酵全液、發酵液、菌絲體的總還原能力均顯著高于空白培養基（P<0.05），且隨著質量濃度的增加，其還原力逐漸增強，在質量濃度為500 mg/mL時，發酵全液和發酵液無顯著性差異，分別為0.711、0.708，菌絲體總還原力為0.841，低于維生素C。

圖8 發酵全液、發酵液、菌絲體的總還原能力Fig.8 Total reducing ability of fermentation liquid,fermentation liquid and mycelium

3 結論

本實驗在單因素實驗基礎上，采用響應面試驗優化猴頭菌液體發酵工藝，確定最佳接種量為8.5%、轉速128 r/min、pH5.9、溫度23.5 ℃，在該發酵條件下得到的發酵液綜合評分為2.090，多糖、核苷、總萜產量分別為5.12、1.17、0.42 mg/mL。對猴頭菌發酵產物進行體外抗氧化活性測定，發酵全液、發酵液、菌絲體均質液對DPPH清除率的IC50值分別166、237、53 mg/mL，對ABTS+自由基清除率的IC50值分別為68、55、72 mg/mL，500 mg/mL時總還原能力分別為0.711、0.708、0.841，同一質量濃度下，菌絲體對DPPH自由基清除能力和還原能力較強，發酵液對ABTS+自由基清除能力較強，發酵全液的綜合抗氧化能力較強。

目前猴頭菌液體發酵條件優化指標還停留在菌絲體生物量上，對其利用也多為提取活性成分，忽略了對發酵過程中菌絲體及發酵液中活性物質產量的考察，本實驗以發酵全液中活性成分產量為指標優化猴頭菌發酵工藝，得到富含多種活性成分的發酵全液，為猴頭菌液體發酵生產、猴頭菌活性物質提取以及功能性食品開發提供了參考。