木姜子精油微膠囊制備工藝優化及其品質分析

張麗紅，黃 夢，王桂瑛 ，尹曉燕，楊子江，田 梅，廖國周 ，葛長榮

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明 650201；2.云南農業大學，云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南昆明 650201）

木姜子（Litsea pungensHemsl.）又名山雞椒、山蒼子、蓽茄澄和山胡椒等[1]，屬于被子植物門樟科木姜子屬，在我國木姜子的產地分布廣泛[2]，是我國特有的木本油料植物之一。木姜子有著極高的醫用價值，人們常將干燥后的果實作為藥材使用[3]。木姜子精油是一種具有活性的木姜子次級代謝產物[4]，為淡黃色半透明油狀液體，香味與檸檬油相似[5]。檸檬醛[6]、檸檬烯[7]等作為木姜子精油中的主要成分，可用于調配、合成香料及制藥工業，為維生素C、維生素E等合成提供原料[8]，同時還具有良好的抗氧化活性和顯著的抑菌作用[9]，在醫藥[10?11]、農業[12]、食品[13]等方面都具有重要的研究價值。然而木姜子精油易受到外界環境中光、水分、空氣和高溫等的影響，發生降解、蒸發或氧化變質，從而限制木姜子精油的應用。

微膠囊技術是一種保護技術，涉及領域較廣，通過微膠囊化，將不穩定的氣體、半固體、液體產品轉變為穩定的固體，方便儲藏和攜帶[14?15]。目前制備微膠囊常用的方法有：噴霧干燥法和真空冷凍干燥法等。冷凍干燥法加工溫度較為溫和，并在無氧條件下操作，適用于敏感和昂貴的生物活性化合物，能夠保護活性成分不被破壞[16]。Charles等[17]以竹芋淀粉和麥芽糊精為壁材，采用冷凍干燥法制備的金槍魚魚油微膠囊，能夠提高貨架期，并有良好的氧化穩定性。常馨月等[18]以酪蛋白酸鈉與D-乳糖-為壁材，采用冷凍干燥法制備奇亞籽油微膠囊，包埋率達90.65%，且熱穩定性良好。雖然木姜子精油的抗氧化性、抗菌性等的研究已有報道，但鮮見針對木姜子精油微膠囊化及品質進行深入分析的報道。

基于此，本實驗以木姜子精油為對象，通過真空冷凍干燥法制備木姜子精油微膠囊，并以微膠囊包埋率為指標，在單因素的基礎上結合正交試驗，對木姜子精油的微膠囊包埋工藝進行優化，同時分析木姜子精油微膠囊的理化性質、微觀結構及在儲藏過程中精油的揮發率和過氧化值，旨在改變木姜子精油易揮發、易氧化變質的缺點，提高其穩定性，為木姜子精油應用前景的拓展提供一定的理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

木姜子精油 云南省畜產品加工工程技術研究中心提供；三氯甲烷、冰乙酸、硫代硫酸鈉、碘化鉀分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；乙醚、石油醚 分析純，成都市科隆化學品有限公司；大豆分離蛋白 食品級，瑞康生物科技有限公司；β-環糊精、阿拉伯膠 食品級，河南圣德實業有限公司；蔗糖脂肪酸酯（以下簡稱蔗糖酯）、單硬脂酸甘油酯（以下簡稱單甘酯） 食品級，上海伊凡爾精細化工有限公司。

XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 北京永光明醫療儀器廠；101-2AB電熱鼓風干燥器 北京中心偉業儀器有限公司；DHG-9070A烘箱 上海-恒科學儀器有限公司；H1650-W離心機 湖南湘儀試驗室儀器有限公司；LGJ-10N真空冷凍干燥機 北京亞星儀科發展有限公司；Sigma300掃描電子顯微鏡 卡爾蔡司（上海）管理有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木姜子精油微膠囊的工藝優化

1.2.1.1 工藝流程 壁材+芯材→乳化→均質→真空冷凍干燥→木姜子精油微膠囊

參考王月月等[19]的方法并做修改：按照配方要求的質量比配制復合壁材與蒸餾水混合溶解，蒸餾水用量按固形物用量添加，其中固形物的含量為加入蒸餾水后芯材和壁材所占微膠囊乳化液的質量分數。之后加入乳化劑，并將混合液置于50 ℃水浴鍋中，利用磁力攪拌器將其攪拌形成均一的乳化液。將溶有乳化劑單甘酯的木姜子精油作為芯材，加入到壁材乳化液中，在一定溫度下乳化30 min，再經10000 r/min均質勻漿3 min，使其形成均勻穩定的乳化液。將均質過后的乳化液靜置于?20 ℃冰箱中冷凍12 h，放入冷阱為?55.2 ℃的真空冷凍干燥機進行冷凍干燥72 h。最后把冷凍干燥后的粉末油脂過60目的篩子，使粉末顆粒大小均一。

1.2.1.2 壁材篩選 阿拉伯膠易溶于水，具有良好的乳化性能，成膜性好。大豆分離蛋白具有親水親油性，具備良好的乳化性能和成膜能力[20]。β-環糊精具有良好的水溶性。選取阿拉伯膠、大豆分離蛋白、β-環糊精兩兩相互組合作為復合壁材，能夠相互彌補在成膜過程中的缺陷。以乳化液的穩定性和包埋率作為評價指標，以此來選擇出適宜的壁材。

1.2.1.3 單因素實驗 真空冷凍干燥法制備木姜子精油微膠囊并以包埋率為指標，考查各因素對木姜子精油包埋率的影響，確定真空冷凍干燥法制備木姜子精油微膠囊最佳因素水平。本實驗選用單甘酯和蔗糖酯作為復合乳化劑，當固形物的含量確定時，復合乳化劑占固形物含量的百分比為微膠囊中乳化劑的含量，并以此來篩選兩種乳化劑的最適比例以及最適用量。

固定復合壁材比例為1:1、乳化劑含量為3%、乳化劑配比為1:3、芯壁材比為1:3、乳化溫度為40 ℃，考察不同固形物含量（10%、15%、20%、25%、30%）對包埋率的影響。固定固形物含量為15%、其他因素不變，考察不同復合壁材比例（大豆分離蛋白：β-環糊精，2:1、1:1、1:2、1:3、1:4, g/g）對包埋率的影響。固定復合壁材比為1:1，其他因素不變，考察乳化劑含量（1%、2%、3%、4%、5%）對包埋率的影響。固定乳化劑含量為3%，其他因素不變，考察乳化劑配比（單甘酯：蔗糖酯，1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，g/g）對包埋率的影響。固定乳化劑配比為1:4，其他因素不變，考察芯壁材比例（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6，g/g）對包埋率的影響。固定芯壁材比為1:4，其他因素不變，考察乳化溫度（30、40、50、60、70 ℃）對包埋率的影響。

1.2.1.4 正交法優化木姜子精油微膠囊的制備工藝結合單因素的實驗結果，以復合壁材比例（大豆分離蛋白：β-環糊精）、芯壁材比例、固形物含量3個因素為考察對象，采用L9（34）正交試驗，并以微膠囊的包埋率作為評價指標，優化木姜子精油微膠囊的包埋工藝。木姜子精油微膠囊正交因素水平表見表1。

表1 木姜子精油微膠囊正交因素水平表Table 1 Essential oil from Litsea pungens Hemsl microcapsule orthogonal factor level table

1.2.1.5 乳化液穩定性的測定 將1.2.1.2中均質后的乳化液倒入帶刻度的離心管中，于3000 r/min離心10 min后，取出并觀察乳化液的分層情況[21]。

1.2.1.6 木姜子精油微膠囊包埋率的測定 參考羅旭洸等[22]的方法并進行修改：經真空冷凍干燥后得到的木姜子精油微膠囊樣品，準確稱取2 g樣品，加入20 mL石油醚之后輕微振蕩浸提1 min，過濾取濾液，重復兩次，合并濾液至錐形瓶中，先將錐形瓶置于60 ℃恒溫水浴鍋中蒸發出大部分石油醚，之后再將錐形瓶置于60 ℃烘箱中恒重。計算式：

式中：m表示樣品質量，g；m1表示恒重后總質量，g；m2表示錐形瓶質量，g。

總油含量的測定：經真空冷凍干燥后得到的木姜子精油微膠囊樣品，采用索氏提取的方法，準確稱取2 g樣品，用無水乙醚回流提取5~8 h，將蒸餾回收提取液中的溶劑倒入已知質量的圓底燒瓶中，置于65 ℃烘箱中恒重。計算式：

式中：m表示樣品質量，g；m1表示恒重后總質量，g；m2表示圓底燒瓶質量，g；

微膠囊包埋率按照公式（4）計算：

1.2.2 木姜子精油微膠囊產品質量評定及微觀結構分析

1.2.2.1 木姜子精油微膠囊水分含量的測定 參照GB/T 5009.3-2016《食品中水分的測定》方法檢測[23]。

1.2.2.2 木姜子精油微膠囊溶解度的測定 參考張玉等[24]的方法：準確稱取5 g木姜子精油微膠囊樣品，置于50 mL燒杯中。分數次加入38 mL 25~30 ℃蒸餾水溶解樣品，并離心10 min，之后將上清液倒去。加入38 mL蒸餾水使沉淀懸浮后，離心10 min，將上清液倒去，再加入少量蒸餾水轉移沉淀至稱量皿中，先于沸水浴中蒸干水分，再于105 ℃烘箱中至恒重。

式中：m1表示稱量皿質量，g；m2表示稱量皿質量和不溶物質量，g；m3表示樣品質量，g；b表示樣品含水率，%。

1.2.2.3 木姜子精油微膠囊堆積密度的測定 參考朱建宇等[25]的方法并進行修改：將微膠囊倒入到量筒中，搖勻振實，準確稱取并記錄所填充的微膠囊質量（m）及填充體積（v），計算公式如下：

1.2.2.4 木姜子精油微膠囊SEM結構觀察 采用掃描電子顯微鏡觀察木姜子微膠囊的表面形貌，將木姜子精油微膠囊分散在貼有導電膠的樣品臺上，并將多余的粉末吹去，噴金后，采用掃描電子顯微鏡觀察其結構，并選取具有代表性的視野進行拍攝。電子槍加速電壓為3 kV。

1.2.3 木姜子精油微膠囊儲藏穩定性分析

1.2.3.1 木姜子精油微膠囊在儲存過程中精油揮發率測定 參考劉雙雙等[26]的方法并進行修改：分別稱取200 mg木姜子精油和含有200 mg木姜子精油的微膠囊于燒杯中，然后放入100 ℃的烘箱中，每間隔6 h分別取樣測定揮發率。計算式：

式中：m0表示樣品初始質量，mg；m1表示樣品剩余質量，mg。

1.2.3.2 木姜子精油及其微膠囊在儲藏過程中過氧化值的測定 分別將木姜子精油和微膠囊置于65 ℃烘箱中使其加快氧化，每間隔48 h分別取樣，測定過氧化值。在測定木姜子精油微膠囊過氧化值時，參考周德紅等[27]的方法，采用堿性乙醚法對微膠囊進行破壁提油處理。其中過氧化值的測定參照GB/T 5009.227-2016《食品中過氧化值的測定》方法檢測[28]。

1.3 數據處理

利用SPSS18.0軟件對數據進行ANOVA方差分析和Duncan′s多重比較分析，P<0.05做顯著差異檢驗的標準，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 壁材的選擇

分別選取蛋白類、碳水化合物類、膠體類壁材中常用的大豆分離蛋白、β-環糊精及阿拉伯膠三種壁材，進行兩兩相互組合為復合壁材制備乳化液。由表2可知，與阿拉伯膠和β-環糊精組合、大豆分離蛋白和阿拉伯膠組合相比，大豆分離蛋白與β-環糊精組合而成的復合壁材乳化液穩定性最高，為88.23%（P<0.05）。同樣，大豆分離蛋白與β-環糊精組合而成的復合壁材包埋率最高，為73.56%（P<0.05）。可能是因為蛋白質在水中不僅具有較好的乳化性而且成膜性好，形成的膜隔氧率高，此外阿拉伯膠的黏度太大，會導致乳化液過粘稠，乳化不充分，穩定性差，包埋率低[29]。因此，綜合以上因素，最終確定復合壁材選用大豆分離蛋白和β-環糊精。

表2 復合壁材的篩選Table 2 Screening of composite wall material

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 固形物含量對包埋率的影響 由圖1可知，當固形物含量低于15%時，微膠囊包埋率隨著固形物含量的增加而增加，在固形物含量為15%時，包埋率最高（P<0.05）。隨著固形物含量繼續增加，微膠囊的包埋率呈下降趨勢，與張玲云等[30]的研究報道類似，這可能是因為當微膠囊中的固形物含量增加時，含水量降低，有利于干燥和囊膜的形成，而當固形物含量達到一定量時，乳化液的黏度增加，乳化不充分，最終導致微膠囊的包埋率下降。綜合以上因素，確定固形物含量為15%時包埋率最優。

圖1 固形物含量對包埋率的影響Fig.1 Effect of solid content on embedding rate

2.2.2 復合壁材比例對包埋率的影響 由圖2可知，微膠囊包埋率隨著β-環糊精比例的增加呈現出先增加后降低的趨勢。當大豆分離蛋白與β-環糊精的比例為1:1時，包埋率達到最高，為70.93%（P<0.05）。這可能是由于大豆分離蛋白能使油水界面之間的張力降低，容易形成穩定的乳化液，但本身容易受外界環境的變化而直接導致其溶解度降低，影響乳化液的穩定性，因此盡可能的降低大豆分離蛋白的含量將有助于提高乳化液的穩定性。而“內疏水，外親水”的β-環糊精有助于油脂的包埋，但當β-環糊精的含量進一步增加或提高時，微膠囊的包埋率下降，這主要是因為大豆分離蛋白的乳化穩定性大于β-環糊精，當大豆分離蛋白含量低時，不能在微膠囊中形成較為穩定的乳化液，導致包埋率降低。綜合以上因素，確定大豆分離蛋白：β-環糊精的最適比例為1:1。

圖2 復合壁材比例對包埋率的影響Fig.2 Effect of composite wall material ratio on embedding rate

2.2.3 乳化劑含量對包埋率的影響 由圖3可知，當乳化劑含量低于3%，微膠囊的包埋率隨著乳化劑含量的增加而增加，當達到一定量時，逐漸趨于平緩，不再上升。劉鑫等[31]研究報道與本結果相似。這可能是因為當乳化劑含量較低時，乳化效果不充分，乳液穩定性差，導致芯壁材不能充分結合。在乳化劑含量為5%時，包埋率為71.66%，與添加量3%和4%間不存在顯著性差異（P>0.05）。表明此時乳化效果已達到飽和。綜合以上因素，確定乳化劑含量為3%。

圖3 乳化劑含量對包埋率的影響Fig.3 Effect of emulsifier content on embedding rate

2.2.4 乳化劑配比對包埋率的影響 由圖4可知，單甘酯比例不變，微膠囊包埋率隨著蔗糖酯比例增加而增加，當單甘酯與蔗糖酯的比例為1:4時，包埋率最高，為72.93%，與1:1、1:2間差異顯著（P<0.05），與1:3、1:5不存在顯著性差異（P>0.05）。這可能是因為單甘酯是親油型的表面活性劑，當其溶解后，可增加乳化液的穩定性。蔗糖酯是親水型的表面活性劑，對水具有優良的乳化性能，加入到溶液后界面張力顯著降低，使體系中的界面狀態發生變化，將兩者結合使用后能夠形成穩定的乳化液，但當其含量較多時，會導致乳化液粘稠。綜合以上因素，確定單甘酯：蔗糖酯為1:4。

圖4 乳化劑配比對包埋率的影響Fig.4 Effect of emulsifier ratio on embedding rate

2.2.5 芯壁材配比對微膠囊包埋率的影響 由圖5可知，芯材比例不變，微膠囊的包埋率隨著壁材比例的逐漸增加而增加，當芯壁材比例為1:4時，此后包埋率逐漸趨于平緩。在芯壁材比為1:6時，包埋率最高，為74.53%，這可能是因為壁材含量的增加有利于提高乳化液的穩定性。但當芯壁材比為1:4時，其包埋率與1:5和1:6間不存在顯著差異（P>0.05），此時壁材可能已完全包埋住芯材，過多的壁材會造成浪費，綜合考慮各因素，因此確定本研究的芯壁材比為1:4。鄭義等[32]研究報道與本結果相似，桂花精油微膠囊包埋率隨著壁材添加量的增加呈先增加后逐漸趨于平緩。

圖5 芯壁材比對包埋率的影響Fig.5 Effect of core wall material ratio on embedding rate

2.2.6 乳化溫度對包埋率的影響 由圖6可知，當乳化溫度低于40 ℃時，微膠囊包埋率隨著乳化溫度的升高而增加，到達40 ℃時，包埋率最高，為74.20%。隨著乳化溫度繼續升高，包埋率呈下降趨勢。這結果與王月月等[33]報道的研究結果類似，這可能是由于溫度升高有利于壁材充分溶解，包埋率增加，但溫度過高會使蛋白質變性，破壞乳化液的穩定性，導致芯壁材不能充分結合，包埋率下降。而在乳化溫度為40 ℃微膠囊的包埋率達到最高。綜合以上因素，確定乳化溫度為40 ℃。

圖6 乳化溫度對包埋率的影響Fig.6 Effect of emulsification temperature on embedding rate

2.3 正交試驗結果

結合單因素的實驗結果，采用L9（34）正交試驗，以包埋率為指標，對木姜子精油微膠囊進行工藝優化。其中，考察因素分別為固形物含量、復合壁材比及芯壁材比。木姜子精油微膠囊正交試驗結果及方差分析見表3、表4。

由表3可以看出：微膠囊包埋效果最好的一組是A2B2C3，即芯壁材比為1:5、復合壁材比（大豆分離蛋白：β-環糊精）為1:1、固形物含量為15%，此時木姜子精油微膠囊包埋率可達到84.68%。且極差RC>RB>RA，表明芯壁材比的影響最大、其次是復合壁材比和固形物含量。由表4正交試驗方差分析的結果可以進一步證實，復合壁材比及芯壁材比對木姜子精油微膠囊包埋率的影響顯著（P<0.05），固形物含量的影響不顯著。苗鈞魁等[34]采用響應面法預測各因素對南極磷蝦油微膠囊包埋率的影響大小關系，結果為芯壁質量比>明膠>酪蛋白酸鈉，與本研究結果類似。

表3 木姜子精油微膠囊正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of microcapsule of essential oil from Litsea pungens Hemsl

表4 正交試驗結果方差分析表Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results

2.4 木姜子精油微膠囊的質量評定

2.4.1 木姜子精油微膠囊的理化指標測定 水分含量關系到微膠囊產品結塊、發霉的速率，直接影響產品品質和貯藏，因此，水分含量是微膠囊產品的重要指標[35]。由表5可知，在最佳工藝條件下所得到的木姜子精油微膠囊產品的水分含量為3.05%，溶解度為91.04%，堆積密度為0.35 g/cm3。結果表明，木姜子微膠囊含水量少，品質優良，有利于貯藏有利于儲藏。

表5 木姜子精油微膠囊理化指標的測定結果Table 5 Results of physical and chemical indexes determination of microcapsule of essential oil from Litsea pungens Hemsl

2.4.2 木姜子精油微膠囊SEM分析 通過掃描電子顯微鏡得到β-環糊精、大豆分離蛋白、木姜子精油微膠囊結構圖，如圖7~圖9所示。如圖7所示，β-環糊精整體呈塊狀分布。如圖8A所示，大豆分離蛋白主要呈球形、塊狀、還有一些不規則的形狀分布；圖8B為其中一個破損的球形的放大圖，可以看出球形內部存在內腔，可以實現對精油包埋。如圖9所示，所得的木姜子精油微膠囊呈不規則塊狀，對比β-環糊精和大豆分離蛋白，木姜子精油微膠囊在結構上發生了明顯的改變。本研究結果與陳琳等[36]采用真空冷凍干燥對紫蘇油的研究結果一致，呈現不規則塊狀。同樣，李一喆[37]采用冷凍干燥制備的橘皮油微膠囊呈現不規則薄片狀。這可能是由于在預凍過程中，液態水形成冰晶，破壞了原有的乳化結構。目前的研究表明，微膠囊根據包埋手段和材料的不同，常為球形也可以為菱形、粒狀和塊狀等[38]。

圖7 β-環糊精電鏡掃描圖Fig.7 SEM image of β-cyclodextrin

圖8 大豆分離蛋白電鏡掃描圖Fig.8 SEM image of soy protein isolate

圖9 木姜子精油微膠囊電鏡掃描圖Fig.9 SEM image of essential oil from Litsea pungens Hemsl

2.5 木姜子精油微膠囊儲藏穩定性分析

2.5.1 木姜子精油及其微膠囊在儲藏過程中精油揮發率變化 木姜子精油及微膠囊的揮發率如圖10所示，木姜子精油和微膠囊化木姜子精油中均有部分的精油隨著時間的延長而揮發，但是二者的揮發速率存在明顯差異。在加熱到30 h時，木姜子精油的揮發率高達43.43%，而微膠囊化木姜子精油的揮發率只有12.35%，微膠囊化木姜子精油的揮發率遠遠低于木姜子精油。經過微膠囊包埋后，壁材對木姜子精油起到了保護作用，使得被包埋的木姜子精油揮發速率減緩。王娣等[39]制備百里香精油微膠囊，其微膠囊的揮發速率遠遠低于精油的揮發速率。由此可見，精油的微膠囊化能夠有效地降低精油的揮發速率。

圖10 微膠囊化對木姜子精油揮發率的影響Fig.10 Effect of microencapsulation on volatilization rate of essential oil from Litsea pungens Hemsl

2.5.2 木姜子精油微膠囊在儲藏過程中過氧化值變化 由圖11可知，木姜子精油及其木姜子精油微膠囊的過氧化值均隨著儲藏時間的延長而增大。在初始階段（0~2 d），木姜子精油微膠囊的過氧化值高于木姜子精油的過氧化值；這是因為在微膠囊制備過程中，精油暴露在環境中，發生氧化反應，導致過氧化值較高。隨后，木姜子精油的過氧化值隨著時間的增長開始慢慢升高，到第6 d后升高速度加快；可能是因為精油中所含有的抗氧化成分起到了一定的保護作用，當抗氧化成分被消耗完后，氧化速度加快。而木姜子精油微膠囊的過氧化值隨著時間的增長也在緩慢上升，但上升速度明顯慢于木姜子精油。在14 d時，比較木姜子精油及其微膠囊的過氧化值，發現后者遠低于前者，實驗結果與香茅油微膠囊[40]、肉桂精油微膠囊[41]、連翹葉精油微膠囊[42]等的研究結果相符，說明微膠囊化有效減緩精油的揮發，提高精油的儲藏穩定性，延長精油儲藏時間。此外，Leimann等[43]采用GS-MS對檸檬草精油微膠囊中α-檸檬醛和β-檸檬醛的含量進行了測定，結果發現其含量在微膠囊后沒有發生損失，表明微膠囊化可以使活性物質得到有效保護，防止營養物質的損失與破壞，提高精油的穩定性，控制活性成分的釋放，達到減緩香氣揮發及減少氧化，延長儲存時間的目的[44]。

圖11 木姜子精油及微膠囊的過氧化值變化Fig.11 Change of peroxide value of essential oil and microcapsule of Litsea pungens Hemsl

3 結論

本實驗得到木姜子精油微膠囊的最佳工藝條件為：復合壁材比為1:1（g/g）、芯壁材比1:5（g/g）、固形物含量15%、乳化劑含量3%、乳化劑配比1:4（g/g）、乳化溫度40 ℃，在此條件下制備出的木姜子精油微膠囊包埋率可達到84.68%。其水分含量、溶解度及堆積密度分別為3.05%±0.09%、91.04%±2.15%、（0.35±0.02）g/cm3，表明采用最佳工藝條件制備的微膠囊品質良好，干燥且利于儲藏。通過電鏡掃描結果顯示木姜子精油微膠囊呈不規則塊狀且包埋較好。隨著時間的增長，木姜子精油微膠囊的揮發率和儲藏過程中油脂的過氧化值均低于木姜子精油的值。木姜子精油微膠囊化，能夠有效減緩精油的揮發速度，同時降低精油發生過氧化的程度。