高產四甲基吡嗪芽孢桿菌的篩選及其對醬香型白酒堆積過程的影響

張 穎，李霄霄，李景輝，劉小敏，謝翔云，盧 君，李長文，張翠英，肖冬光,

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 3004571；2.貴州國臺酒業股份有限公司，貴州仁懷 564501）

四甲基吡嗪（tetramethyl pyrazine，TTMP），是一種天然的香料，具有烤焙、堅果、可可等香氣，可以作為風味添加劑[1]。TTMP也是白酒中重要風味物質的組成成分，賦予白酒一定的保健作用，在不同香型的白酒中含量不同，在醬香型白酒中含量最高。白酒釀造過程中TTMP主要是由芽孢桿菌發酵代謝合成，一方面微生物通過糖酵解途徑產生丙酮酸，兩分子丙酮酸縮合形成α-乙酰乳酸，在α-乙酰乳酸脫羧酶的作用下生成乙偶姻；另一方面微生物酶分解原料中蛋白質和氨基酸產生氨，進而乙偶姻和氨發生非酶促反應合成TTMP。

通過分離篩選高產TTMP的微生物進而來穩定和提高白酒中四甲基吡嗪含量是一種常用的手段，徐巖等[2]將具有相應釀造功能的微生物菌劑進行復配組合，使用菌劑生產的芝麻香型白酒頭段酒中的吡嗪類物質含量達到175 μg/L，相比未使用菌劑提高了33.6%。袁建國等[3]通過添加芽抱桿菌B-010，使芝麻香型白酒中的TTMP含量由0.4 mg/L提高到1.8 mg/L；張溫清[4]將高產TTMP芽孢桿菌菌液接入芝麻香型白酒堆積糟醅中培菌后入窖發酵，結果發現，接種功能菌 XJB-104原酒中TTMP含量從0.06 mg/L增加到1.39 mg/L；王曉丹等[5]從高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌添加到窖池中層的糟醅中，按照粹沙工藝制酒取樣，結果最佳菌株添加量為5%，此時發酵后的酒醅TTMP含量為6.81 μg/g，是對照組的3.03倍，酒樣中TTMP相對百分含量為0.028%。

TTMP在醬香型、芝麻香型和兼香型白酒中的含量顯著高于其它香型白酒的主要原因，是都有堆積培菌過程，在堆積糟醅中有較高的含氧量，有利于好氧芽孢桿菌的生長代謝，合成較多的TTMP。如直接入窖發酵，糟醅中的氧在發酵前期很快被兼性厭氧的酵母菌等微生物耗盡，好氧芽孢桿菌的生長與TTMP的合成將受到限制。本研究從醬香型白酒大曲中篩選出的1 株高產TTMP的地衣芽孢桿菌，并將其種子液添加到醬香型白酒第5輪次的酒醅中進行堆積培菌，探究地衣芽孢桿菌對堆積培菌過程的影響，進而探討在醬香白酒生產中使用的可行性，旨在通過該菌劑強化堆積培菌過程提高白酒中的TTMP含量，從而改善白酒的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糟醅、高溫大曲 貴州國臺酒業公司；氫氧化鈉、斐林試劑、葡萄糖、硫酸、甲醛、鹽酸等 均為國產分析純；四甲基吡嗪、乙偶姻、無水乙醇 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DNA提取試劑盒 成都福際生物技術有限公司。

7890B氣相色譜儀、1200SL液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；CX21FS1型生物顯微鏡 日本OLYMPUS會社；LD5-10離心機 北京醫用離心機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基與溶液 分離培養基的配制。LB培養基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養基的配制。干酪素10.0 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1000 mL，pH為7.0~7.2，121 ℃滅菌20 min。

一級種子培養基的配制。LB培養基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.2，于121 ℃滅菌20 min。

代謝發酵培養基的配制。12°BX高粱水解液，酵母浸粉15 g/L，K2HPO45 g/L，NaCl 5 g/L，pH調至6.0，于115 ℃滅菌20 min。

固態發酵培養基。貴州國臺酒第5輪次蒸酒后糟醅。

0.1 mol/L PBS緩沖液：A液（0.1 mol/L KH2PO4）：1.361 g KH2PO4溶于100 mL蒸餾水；B液（0.1 mol/L Na2HPO4）：1.78 g Na2HPO4·2H2O溶于100 mL蒸餾水；A液與B液按照1:19的比例混合，pH為8.0，于115 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2.2 高產蛋白酶活力芽孢桿菌菌株的分離與篩選

1.2.2.1 菌種分離 稱取大曲粉10 g，放入含有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶，在85 ℃水浴10 min，以200 r/min轉速在37 ℃振蕩培養箱過夜擴培，吸取培養液1 mL，放入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管內，吹吸混勻，按上述操作繼續稀釋，稀釋到1×10?6，取稀釋度為1×10?4~1×10?6各1 mL分別涂板分離，以37 ℃培養24 h。分離出不同菌落形態的菌株，將菌株劃線純化，于?80 ℃下超低溫保存。

1.2.2.2 高產蛋白酶活力菌株的篩選 蛋白酶透明圈實驗：將分離得到的菌株用酪蛋白瓊脂培養基做透明圈實驗，以透明圈作為考察指標進行初篩。將菌株以點接法接種到酪蛋白瓊脂培養基上，37 ℃倒置培養1 d后觀察透明圈大小，并用直尺測量透明圈直徑D（mm）和菌落直徑d（mm）的比值（D/d），選出能產生較大透明圈的菌株。

1.2.3 高產TTMP菌株的篩選與分子鑒定

1.2.3.1 高產TTMP菌株的篩選 一級培養：將分離出的芽孢桿菌經活化后接入LB種子培養基培養24 h。

代謝發酵：按5%接種量接入裝有50 mL代謝培養基的250 mL三角瓶中，以200 r/min轉速在43 ℃下振蕩培養84 h。代謝發酵結束后，利用HPLC檢測發酵液中乙偶姻和四甲基吡嗪含量。

1.2.3.2 分子鑒定 采用細菌DNA提取試劑盒對各菌株提取菌株基因組DNA，利用細菌通用引物27F/1492R進行PCR擴增，PCR產物交由上海金唯智公司進行測序鑒定，對菌株進行16S rDNA序列分析。

1.2.4 地衣芽孢桿菌GTBL-168對醬香型白酒堆積過程的影響 在糟醅中加入7%的大曲粉拌勻，每個250 mL三角瓶中分裝120 g，挑選代謝發酵液中TTMP含量最高的菌株，將其發酵液作為種子液按照0%、3%、5%、7%的比例接種于拌有大曲的糟醅中，拌勻，6層紗布封口，30 ℃堆積12 h，37 ℃堆積36 h，在無菌條件換成膠塞后繼續在45 ℃下堆積24 h，同時做平行實驗，測定堆積結束后糟醅的乙偶姻和TTMP含量、理化指標及菌群結構。

1.2.5 乙偶姻含量的檢測方法 發酵液樣品的前處理：取發酵液2 mL，12000 r/min離心5 min，取上清，用流動相5 mmol/L的稀硫酸溶液稀釋10倍后用0.22 μm的微孔濾膜過濾，直接進樣。

堆積糟醅樣品的前處理：取10 g糟醅加100 mL蒸餾水超聲30 min，12000 r/min離心2 min，取上清液經0.22 μm的水相膜過濾后進行液相色譜檢測。

高效液相色譜條件：Aglient HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm×9 μm），檢測器為示差檢測器（RID）（45 ℃），柱溫65 ℃，流動相為5 mmol/L的稀硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，進樣量20 μL。

采用HPLC檢測乙偶姻含量，通過外標法進行乙偶姻的定量分析，標準回歸方程為y=190998x?52137，R2=0.9935。

1.2.6 TTMP含量的檢測方法

1.2.6.1 發酵液中TTMP的測定方法 樣品的前處理：取發酵液2 mL，12000 r/min離心5 min，取上清，用40%乙醇溶液稀釋10倍后用0.22 μm的微孔濾膜過濾，直接進樣。

高效液相色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C18（4.6×250 mm），紫外（Ultra Violet，UV）檢測器，以甲醇:水（v/v）=35:65作為流動相，柱溫40 ℃，流速為1 mL/min，檢測波長278 nm，檢測時間45 min，進樣量20 μL。

采用HPLC檢測發酵液中TTMP含量，通過外標法進行TTMP的定量分析，標準回歸方程為y=63.563x?0.4614，R2=1。

1.2.6.2 堆積糟醅中TTMP的檢測方法 樣品的前處理：取50 g堆積培養結束后的糟醅加5 mL無水乙醇和200 mL蒸餾水進行蒸餾，接取100 mL餾分，將餾分經0.22 μm無機濾膜過濾后直接進樣進行氣相色譜分析，分析餾分中TTMP含量。

氣相色譜條件：色譜柱 HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm）；載氣為純度 99.99%的氮氣；柱流速為0.8 mL/min；進樣口溫度200 ℃；檢測器溫度150 ℃；程序升溫，起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進樣體積為1 μL；分流進樣，分流比為10:1。

采用GC檢測堆積糟醅中TTMP含量，通過外標法進行TTMP的定量分析，標準回歸方程為y=212.9x?230.85，R2=0.9995。

1.2.7 堆積糟醅理化指標的測定 酸度的測定：采用酸堿滴定指示劑法；殘淀粉的測定：采用斐林試劑法；氨基酸態氮的測定：酸度計法；殘糖的測定：斐林試劑法。具體參照DB 34/T 2264-2014《固態發酵酒醅分析方法》[6]。

1.2.8 糟醅群落組成分析

1.2.8.1 樣品的前處理 將100 mL PBS緩沖液（pH8.0）和酒醅樣品充分混合，使用布氏漏斗過濾混合液體，并用200 mL PBS緩沖液沖洗濾渣3~5次。將濾液在7000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集底部菌泥于?20 ℃保存。

1.2.8.2 群落組成分析 將預處理后的樣品送至上海派諾森生物科技有限公司進行16S和ITS測序，按照QIIME2 dada2分析流程進行序列去噪或OTU聚類，使用云平臺分析菌落多樣性指數及群落組成變化情況。

1.3 數據處理

使用SPSS23分析實驗數據，各實驗均重復3次，所有數據均通過方差（ANOVA）方法進行分析，所有均值均以P<0.05的水平進行分離。通過差異分析了不同實驗數據的意義。所得數據均使用Origin軟件繪制數據柱狀圖?；贗llumina MiSeq測序平臺，群落組成圖利用R語言工具進行繪制。

2 結果與分析

2.1 高產蛋白酶活力芽孢桿菌菌株的分離與篩選

蛋白酶分解蛋白質生成的氨基酸為釀造體系提供N源，同時也是風味前體物質，氨基酸進一步分解生成氨，為合成TTMP提供了前體物質。按照1.2.2.2的方法進行蛋白酶透明圈實驗，測得其透明圈直徑與菌落直徑比值HC值，結果如表1所示。菌株144的HC值最大，說明其對培養基中干酪素的分解利用能力較強，即產蛋白酶的活力較高。挑選HC值大于等于1.3的菌株進行液態代謝發酵。

表1 透明圈HC值Table 1 HC value of the transparent circle

2.2 產TTMP芽孢桿菌的篩選與鑒定

白酒中的TTMP由乙偶姻和氨反應生成。按照1.2.5和1.2.6的方法測定發酵液中乙偶姻和TTMP的含量，實驗結果如圖1所示。5株芽孢桿菌中有2株產TTMP，其中菌株GTBL-168產乙偶姻含量為17.51 g/L，產TTMP含量為12.22 mg/L。對照表1蛋白酶活性大小，菌株GTBT-144雖具有較高的蛋白酶活力，但產乙偶姻較少，而菌株GTBT-90乙偶姻含量較多，但蛋白酶活力相對較低，均未合成TTMP。因此，高產TTMP的功能菌篩選需同時具有較高的產蛋白酶和乙偶姻能力，該菌才可能代謝生成高含量的TTMP。

圖1 液態發酵液中乙偶姻、TTMP含量Fig.1 Content of acetoin and TTMP in liquid fermentation broth

按照1.2.3.2的方法，將菌株GTBL-168測序結果提交至NCBI，并進行BLAST同源性比對，菌株GTBL-168與地衣芽孢桿菌的同源性達到99%以上，用 MEGA5.0構建系統發育樹（圖2）。通過系統發育樹分析，將菌株GTBL-168鑒定為一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖2 菌株GTBL-168 16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain GTBL-168 based on the 16S rDNA gene homology

2.3 地衣芽孢桿菌GTBL-168對堆積過程酒醅理化指標的影響

在酒的生產過程中，受不同的原料、菌種和生產工藝等因素的影響，酒的風味各有不同，醬香型白酒獨特的高溫堆積和高溫制曲工藝對醬香風味有重要作用。在堆積過程加入功能芽孢桿菌與傳統大曲協同堆積發酵，影響菌群結構，酒醅的理化指標受到影響，從而影響酒的質量。

按照方法1.2.7測定堆積后糟醅的理化指標，結果如圖3所示，在堆積過程結束后的糟醅中，相比于對照組實驗，功能芽孢桿菌的添加對堆積過程各理化指標影響較明顯，當接種量為7%時，總酸含量和氨基氮含量有所增加，氨基氮的增加促進了產酸菌的生長，從而總酸含量也有所提高。地衣芽孢桿菌所產蛋白酶最適作用pH為7.0[7]，而糟醅酸度較大，不適于蛋白酶發揮作用，因此氨基氮含量較對照組差異不顯著，芽孢桿菌接種量不斷增加至7%時，才有一定的積累。

圖3 堆積糟醅中理化指標情況Fig.3 Physical and chemical indicators in piled fermented glutinous rice

2.4 地衣芽孢桿菌GTBL-168對堆積糟醅中乙偶姻和TTMP含量的影響

按照方法1.2.5和1.2.6分別檢測糟醅中乙偶姻的含量和糟醅餾分中TTMP的含量，結果如圖4所示，加菌組較空白組的酒醅中乙偶姻含量隨接種量的增加而增加，當接種量為7%時乙偶姻含量為6.05 g/L，較對照組2.23 g/L增加了171.30%，同時TTMP含量也有所增加，當接菌量為7%時含量為2.66 mg/L，比對照組增加了24.88%。據報道乙偶姻和氨合成TTMP的最適pH為6.5[8]，本次堆積實驗中乙偶姻提高幅度大，而TTMP增加幅度較小，可能是由于白酒糟醅酸度較大，且體系中氨的含量較少，不利于乙偶姻轉化合成TTMP。

圖4 堆積糟醅中乙偶姻和TTMP含量Fig.4 Content of acetoin and TTMP in the piled grains

2.5 地衣芽孢桿菌GTBL-168對堆積過程菌群結構的影響

利用16S、ITS測序技術對添加不同量功能菌進行堆積發酵實驗后的糟醅中微生物進行多樣性分析。對測序結果進行嵌體過濾，得到有效數據，后續所有分析將建立在有效數據的基礎上進行。

2.5.1 堆積過程中細菌群落結構多樣性分析

2.5.1.1 細菌群落測序數據統計 細菌測序結果共得到498423條高質量的序列，平均每個樣本具有124605±7059條序。在OTU聚類結果中，對樣品進行Alpha多樣性分析，可估算環境群落物種的豐度和多樣性[9]。分別用Chao指數和Shannon指數表示菌群豐富度指數和菌群多樣性指數。Shannon可估計微生物多樣性，Shannon值越大，群落多樣性越高。Chao指數是用Chao1算法估計群落中含OTU數目的指數，在生態學中常用來估計物種總數，值越大代表物種總數越多。

各堆積樣本細菌群落測序數據如表2所示，按照相似性將得到的樣品所對應的分類序列條數歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。其中，接種量為3%的堆積糟醅中OTU數量最多，共2229個，所有樣品共有的細菌OTU數量為170；Chao值代表細菌豐富度指數，Shannon值代表細菌多樣性指數，各堆積酒醅樣品的Chao1指數在1586.38~3107.84之 間，Shannon指 數 在5.36~6.92之間，接種量為3%的堆積糟醅的Shannon指數最高，值為6.92；所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.9826~0.9926之間，所以測序結果能夠完整反映各接種量堆積糟醅樣品細菌菌群組成信息?？梢姽δ芫奶砑訉Χ逊e過程細菌菌群結構有所影響。

表2 酒醅細菌菌落測序數據統計分析Table 2 Statistical analysis of bacteria community sequencing data of fermented grains

2.5.1.2 不同接種量堆積樣品細菌種群結構分析對比不同接種量堆積糟醅中屬水平下細菌群落結構組成，四個堆積糟醅中細菌屬水平TOP10如圖5所示，其中豐度大于1%的有9個屬，包括鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、氣單孢菌屬（Aeromonas）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、Muribaculaceae屬。其中，有4個屬豐度較高，是堆積過程的絕對優勢菌屬，分別是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）。其中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）占絕對優勢，相對豐度為24.55%~37.12%，且豐度隨著功能菌接種量的變化而變化?？肆_彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）相對豐度為18.58%~38.58%，豐度隨著功能菌接種量的增加而增加，豐度從最初的18.58%增加至38.58%。芽孢桿菌屬（Bacillus）相對豐度隨著功能菌接種量的增加而增加，從最初的4.99%增加至12.21%。海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）隨接種量的增加先增加后減少，接種量為3%時豐度最大，為6.44%。

圖5 屬水平下細菌群落結構組成分析Fig.5 Distribution of bacterial community structure at genus level

鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）廣泛存在于堆積酒醅中，具有較強的代謝能力，可將糖類物質轉變成酸?？梢酝茰y該菌屬可能是導致堆積糟醅酸含量較高的重要原因?？肆_彭斯特菌屬（Kroppenstedtia），是高溫大曲中細菌厚壁菌門（Firmicutes）的第2優勢菌屬，且是一種嗜熱菌屬[10]。王歡等[11]也發現其為醬香白酒機械化釀造的核心細菌屬。目前在白酒中的作用尚不明確。在洋河大曲評定高通量測序中，為優等曲的優勢菌屬，是有益菌[12]。袁再順[2]發現其與酸性蛋白酶，纖維素酶，糖化酶和液化酶的活力呈顯著正相關。芽孢桿菌屬（Bacillus）是白酒醬香風味物質的主要貢獻菌屬，是產四甲基吡嗪的主要菌種。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能夠產生典型的醬香風味，氣質分析發現這倆株菌代謝產生了5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸、α-亞麻酸等新的風味成分[13]。一些枯草芽孢桿菌、環狀芽抱桿菌等均有較強的蛋白酶和淀粉酶活力，可以降解原料中的大分子物質[14]。其隨著接種量的增加豐度不斷增加，與在接種量7%時TTMP含量最高相吻合，可見其是堆積糟醅中TTMP的主要功能菌。海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus），主要分布于深海環境、發酵食品與發酵設備[15]。在醬香型白酒高溫大曲傳統制曲和機械制曲過程中第二次翻曲階段，該屬為主要菌屬，但具體功能未見報道[16]。且該屬的某些物種可以用于生產工業酶制劑，包括氧化酶、淀粉酶、過氧化氫酶、酯酶和脲酶等[17]。

2.5.2 堆積過程中真菌群落結構多樣性分析

2.5.2.1 真菌群落測序數據統計 真菌測序結果共得到514831條高質量的序列，平均每個樣本具有128707±16879條序列。分別用Chao指數和Shannon指數表示菌群豐富度指數和菌群多樣性指數。各堆積樣本真菌群落測序數據如表3所示，按照相似性將得到的樣品所對應的分類序列條數歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit, OTU）。其中，空白實驗的堆積糟醅中OTU數量最多，共104個，所有樣品共有的真菌OTU數量為31；Chao值代表真菌豐富度指數，Shannon值代表真菌多樣性指數，各堆積酒醅樣品的Chao1指數在71.50~118.10之間，Shannon指數在1.95~2.63之間，接種量為7%的堆積糟醅的Shannon指數最高，值為2.63；所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.999958~0.999984之間，所以測序結果能夠完整反映各接種量堆積糟醅樣品真菌菌群組成信息?？梢姽δ芫奶砑訉Χ逊e過程真菌菌群結構有所影響。

表3 酒醅真菌菌落測序數據統計分析Table 3 Statistical analysis of fungal community sequencing data of fermented grains

2.5.2.2 不同接種量堆積樣品真菌種群結構分析對比不同接種量堆積糟醅中屬水平下真菌群落結構組成，將豐度低于1%的菌屬合并在“其他”中顯示，四個堆積糟醅中真菌屬水平TOP10如圖6所示，其中豐度大于1%的有9個屬，主要包括紅曲霉屬（Monascus）、Rasamsonia、毛霉屬（Mucor）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、雞土從菌屬（Termitomyces）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）。其中，有5個屬豐度較高，是堆積過程的優勢菌屬，分別是紅曲霉屬（Monascus）、Rasamsonia、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）。其中紅曲霉屬（Monascus）相對豐度為4.91%~10.79%，豐度隨著功能菌接種量的變化而變化。Rasamsonia屬相對豐度為3.48%~7.57%，在接種量3%時豐度最大。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）相對空白來說，添加功能菌后的堆積糟醅中其相對豐度均有所增加，且接種量3%時豐度最大。

圖6 屬水平下真菌群落結構組成分析Fig.6 Distribution of fungal community structure at genus level

紅曲霉屬（Monascus），是白酒釀造過程中的重要功能菌屬，有較高的糖化酶、蛋白酶等多種酶活力，同時具有較強的酯化能力，且在白酒釀造中產生豐富的香味物質，從而平衡協調口感，增強酒體的綿柔度[18]。其也是紅心曲中主要產紅色素的優勢菌株。固態發酵時可以產酯類物質，在醬香型白酒中發現有紅曲霉的大曲是好曲[19]。紅曲霉可以產生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶和酯酶，且具有生產紅曲色素、Lovastatin、麥角固醇和乙醇的能力[20]。芽孢桿菌的添加使紅曲霉相對豐度降低，可能是因為其他菌屬因氮源增加而豐度增加，但紅曲霉生長較慢，從而使相對豐度減少。Rasamsonia屬是一種絲狀真菌，在堆積糟醅及大曲的微生物多樣性實驗中均有發現[21?23]，目前功能尚不明確。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），是醬香型白酒大曲中的優勢菌群[24]，能夠產生熱穩定的水解酶，在白酒釀造過程中能夠降解原料中的淀粉或纖維素大分子物質，是重要的功能菌屬[25]。曲霉屬（Aspergillus）也是一種絲狀真菌，該菌屬為醬香型白酒大曲和酒醅中的優勢菌屬，環境耐受性較強，可以同時分泌產生糖化酶和蛋白酶，是醬香型白酒釀造過程中的重要產酶功能菌[26]。其可以調控大曲和酒醅的糖化力、酯化力、液化力，并且代謝產生有機酸等，催化生成芳香脂類物質，進而改善酒體風味[27]。嗜熱真菌屬（Thermomyces）是醬香型白酒發酵過程的優勢菌屬，能產生高活力且耐熱的纖維素酶、蛋白酶等酶類，有利于微生物的繁殖生長代謝以及產酒生香[16]。

3 結論與討論

從大曲中分離出了13株菌，并挑選出蛋白酶透明圈HC值大于等于1.3的5株菌株進行液態發酵培養，結果篩選出了一株產TTMP含量較高的地衣芽孢桿菌GTBL-168，其產乙偶姻含量為17.51 g/L，產TTMP含量為12.22 mg/L；結合產蛋白酶情況可以發現，高產TTMP的功能菌需同時具有較高的產蛋白酶和乙偶姻能力，該菌才可能代謝生成高含量的TTMP，研究結果為進一步選育高產TTMP菌株提供了理論指導。

將該功能菌株的液態發酵液作為種子液添加到拌有大曲的糟醅中協同堆積培養，通過加菌組和空白組酒醅的對比，該功能芽孢桿菌提高了堆積糟醅中TTMP的含量，當接菌量為7%時增量最大，乙偶姻含量為6.05 g/L，較對照組2.23 g/L增加了171.30%，TTMP含量為2.66 mg/L，比對照組增加了24.88%，可能是因為糟醅酸度較高且氨含量不足，因此乙偶姻轉化合成TTMP效率較低，而氨含量的不足可能是因為蛋白酶活力不高導致的。如果對該菌株通過誘變等手段提高其蛋白酶活力，則可能會大輻度提高TTMP的產量。

功能菌的添加對堆積過程糟醅的理化性質影響較明顯，氨基氮含量和總酸均有所提高，推測是氨基氮的提高促進了產酸菌的生長；堆積糟醅中除紅曲霉屬以外的其他優勢細菌屬和真菌屬相對豐度均有所增加，可能是因為芽孢桿菌的添加提高了糟醅中氮源含量從而促進了其他菌屬的生長，而紅曲霉生長速度較慢導致相對豐度降低；且糟醅中芽孢桿菌屬豐度的增加與TTMP含量增加相吻合。地衣芽孢桿菌GTBL-168的添加對白酒整體風味的影響，有待通過進一步生產試驗驗證。