綠豆皮中黃酮類化合物的抗氧化活性及其結(jié)構(gòu)分析

陳洪生，國 慧，刁靜靜 ，張東杰,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，糧食副產(chǎn)物綜合利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319）

綠豆（Vigna radiata）是一種藥食同源的食用豆，其富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素，還含有豐富的多酚、酚酸和黃酮類化合物等活性成分，這些活性成分由于其較強(qiáng)的抗氧化能力而有利于預(yù)防癌癥、糖尿病、心血管疾病等非傳染性慢性病[1?2]。我國在對綠豆進(jìn)行工業(yè)利用過程中會產(chǎn)生大量綠豆皮，這些綠豆皮多被用作動物飼料或者直接廢棄物[3]。綠豆皮中含有大量的黃酮類、多酚類化合物，這些功效成分具有抗腫瘤[4]、降低血脂、降膽固醇等生理功能[5]。因此，綠豆皮可以用來制取黃酮類物質(zhì)，以提高資源利用率。近年來，國內(nèi)外有關(guān)綠豆皮的研究主要集中在功能成分的制取及營養(yǎng)功效評價(jià)，朱文學(xué)等[6]采用超聲波輔助水提取綠豆皮黃酮工藝的研究；Yao等[4]和Peng等[7]的研究發(fā)現(xiàn)綠豆中富含多酚，這些酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。Lee等[8]研究發(fā)現(xiàn)綠豆皮提取物黃酮具有抗炎作用。羅磊等[9]研究表明綠豆皮黃酮對氧化損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。以上這些研究都證實(shí)綠豆皮黃酮具有較好的抗氧化、抗炎等生物活性，但綠豆皮黃酮類物質(zhì)中起主要作用的活性組分的具體組成，目前還不甚清楚。

本試驗(yàn)采用自主研制的連續(xù)化制備色譜對綠豆皮黃酮粗提物進(jìn)行梯度分離，收集不同分級產(chǎn)物分析其抗氧化能力，采用LC-MS分析具有最強(qiáng)抗氧化能力級分的結(jié)構(gòu)，以得出綠豆皮黃酮中最強(qiáng)抗氧化活性的組分結(jié)構(gòu)，以期為綠豆皮的高值化利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山西明綠豆 大慶薩爾圖區(qū)博微物資經(jīng)銷處；AB-8大孔吸附樹脂 購于天津南開大學(xué)樹脂有限公司；蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-iphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2′-azinobis-3-ethylbenzothiazoline -6-sulphonic acid，ABTS） 上海Macklin公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） Sigma公司；乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）、三氯化鐵、水楊酸、亞硝酸鈉、氧氧化鈉、無水乙醇、硝酸鋁等試劑安達(dá)市清順化學(xué)試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidative capability，T-COA）試劑盒 購于南京建成生物工程研究所。

AL-204電子天平 北京瑞澤康科技有限公司；粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；連續(xù)化制備型不銹鋼分離柱 實(shí)驗(yàn)室自制；UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)：AcquityTMultra型高效液相色譜儀 美國Waters 公司；TU1810 型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；CW-200 型超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆皮黃酮粗提液的制備 采用康維良等[10]的方法稍作改動，將綠豆皮在40 ℃下恒溫干燥，粉碎，過80目篩后密封保存。配制料液比為1:31（g/mL）綠豆皮粉末樣品溶液，采用超聲-微波協(xié)同萃取儀進(jìn)行綠豆皮黃酮的提取，微波功率為521 W，時(shí)間30 min，結(jié)束后將提取物進(jìn)行3500 r/min離心10 min，收集上清液，低溫保存?zhèn)溆茫玫骄G豆皮黃酮粗提液（測得綠豆皮提取物中黃酮含量為2.26%）。

1.2.2 綠豆皮黃酮的分離純化 采用本實(shí)驗(yàn)室自制的連續(xù)化制備型不銹鋼分離裝置，根據(jù)課題組前期分離純化條件對綠豆皮黃酮粗提物進(jìn)行分離純化。以1 mL/min流速將綠豆皮黃酮粗提物泵入分離柱中進(jìn)行飽和吸附，然后分別采用1~1.5倍體積的20%、40%、60%、80%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集不同洗脫級分的洗脫液備用。

1.2.3 綠豆皮黃酮抗氧化能力的測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定 參照陳青青等[11]方法稍作改動，分別取樣品0.1 mL樣品（濃度2%），加入3.9 mL DPPH（30 μmol/L）溶液，避光30 min，517 nm測吸光度，按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為靜置30 min后樣品的吸光度；A2為等體積的乙醇對照的吸光度；A3為待測樣品與DPPH等體積乙醇吸光度。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力 參照陳青青等[11]方法，分別取樣品0.1 mL樣品（濃度2%），加入5 mL ABTS+·工作液靜置10 min，734 nm測吸光度，以0.1 mL乙醇作為對照。ABTS+自由基清除率按式（2）計(jì)算；

式中：AS為乙醇對照組吸光度；Am為樣品吸光度。

1.2.3.3 羥自由基清除能力 參照封燕等[12]的方法稍作改動，分別取樣品0.1 mL樣品（濃度2%），依次加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴 30 min，510 nm測吸光度，以0.1 mL蒸餾水代替樣品作為對照組。羥自由基清除率按式（3）計(jì)算；

式中：Ai為待測樣品吸光度；Aj為對照組吸光度；A0為雙蒸水代替H2O2溶液作為底物對照的吸光度。

1.2.3.4 T-AOC的測定 采用T-AOC檢測試劑盒進(jìn)行分析。

1.2.4 綠豆皮黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)分析 稱取10 mg凍干后的樣品粉末，加甲醇10 mL溶解，10000 r/min離心15 min，取上清液用于測試。使用0.1%甲酸乙腈為流動相，流速為0.5 mL/min，檢測波長280 nm。采用Waters T3色譜柱（50 mm×3.0 mm i.d. ,1.8 μm），進(jìn)樣量5 μL，柱溫箱40 ℃。采用UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)進(jìn)行黃酮結(jié)構(gòu)測定，并根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索和推測黃酮類化合物組分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的平均值，用Statistix 8（分析軟件, St Paul, MN） 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，平均數(shù)之間顯著性差異（P<0.05）通過Turkey HSD進(jìn)行多重比較分析。并采用SigmaPlot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆皮黃酮類化合物的分離

圖1 反映的是綠豆皮黃酮梯度洗脫樣品圖。由圖1可知，綠豆皮黃酮飽和吸附后，采用不同洗脫溶劑等體積洗脫制備得到的綠豆皮黃酮級分濃度不同，隨著洗脫劑乙醇濃度的增強(qiáng)，洗脫樣品的顏色也逐漸變深，其中60%洗脫樣品顏色最深，表明60%洗脫樣品中得到的溶質(zhì)相對較多，80%醇洗液在連續(xù)分離中既可將分離柱中的剩余組分洗脫下來，還可起到清洗分離柱的效果，以保證分離柱的下一輪吸附洗脫。圖2反映的是綠豆皮黃酮梯度洗脫四個(gè)級分的得率。由圖2可知，四種洗脫溶劑得到的黃酮類化合物濃度分別為0.0056、0.021、0.0257、0.0044 mg/mL，與圖1結(jié)果結(jié)合分析得出，綠豆皮黃酮類化合物集中在40%和60%洗脫樣品中，達(dá)到綠豆皮黃酮粗提物的80%以上；其中60%洗脫樣品濃度最高；20%醇洗液由于極性相對較低，洗脫液中含量較低；由于綠豆皮黃酮類化合物集中在40%和60%洗脫樣品中，因而80%醇洗液中樣品也較低。結(jié)合圖1和圖2也可以看出綠豆皮黃酮類化合物組分集中在40%~60%醇洗液中。

圖1 綠豆皮黃酮洗脫樣品圖Fig.1 Elution sample diagram of flavonoids from mung bean hull

圖2 綠豆皮提取物梯度洗脫樣品黃酮濃度Fig.2 Concentrations of flavonoid of mung bean hull extract by gradient elution

2.2 不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力

圖3 反映的是梯度洗脫后不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力。由圖可知，等濃度的各個(gè)洗脫級分的DPPH·、ABTS＋·、·OH清除能力和總抗氧化能力不同，20%、80%洗脫級分的抗氧化能力最低，60%洗脫級分的抗氧化能力顯著強(qiáng)于其他洗脫級分（P<0.05），與未分級樣品相比，60%洗脫級分的ABTS＋·、·OH清除能力和總抗氧化能力顯著高于等濃度的黃酮粗提物（P<0.05），但DPPH·清除能力顯著低于黃酮粗提物（P<0.05），這說明洗脫樣品中的組分與未分級綠豆皮黃酮粗提物存在不同，不同的抗氧化組分其作用效果及機(jī)理不同，這與自由基種類也存在一定的相關(guān)性，ABTS+·和·OH屬于帶電荷的自由基，而DPPH·卻并不帶電荷，所以抗氧化效果不同；40%洗脫級分盡管抗氧化能力強(qiáng)于20%和80%洗脫樣品，但顯著低于60%洗脫級分（P<0.05），這也表明不同洗脫樣品中的組分不同，因此抗氧化能力不同，也表明綠豆皮黃酮中主要抗氧化組分集中在60%洗脫液中。

圖3 不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of mung bean hull flavonoid from different fractions

2.3 60%醇洗脫綠豆皮黃酮類化合物結(jié)構(gòu)分析

圖4 反映的是60%醇洗樣品的液相色譜圖，由圖可知，純化后綠豆皮黃酮樣品中的吸收峰主要有3個(gè)，分別出現(xiàn)在4.59、6.06和6.20 min，說明60%醇洗脫液中綠豆皮黃酮類化合物主要含有3種物質(zhì)。

圖4 60%乙醇洗脫液中黃酮類化合物的液相分析圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of mung bean hull flavonoids in 60% ethanol elution liquid

2.3.1 成分Ⅰ分析 圖5是成分I的一級二級質(zhì)譜圖和可能的結(jié)構(gòu)式。該化合物的出峰時(shí)間為4.59 min，[M-H]?為449.1107，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C21H22O11，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-90-H]、[M-120-H]等碎片離子，該化合物為碳苷，且含有六元糖，根據(jù)cifinder和reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷（eriodictyol-6-C-β-D-glucopyranoside）。

圖5 成分Ⅰ的一級（A）、二級（B）質(zhì)譜及可能的結(jié)構(gòu)式（C）Fig.5 Ingredients I primary(A), secondary(B) mass spectrogram and possible structural formula(C)

2.3.2 成分Ⅱ分析 圖6是成分II的一級二級質(zhì)譜圖和可能的結(jié)構(gòu)式。該化合物的出峰時(shí)間為6.06 min，[M-H]?為431.0992，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C21H20O10，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-90-H]、[M-120-H]等碎片離子，該化合物的為碳苷，且含有六元糖，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，根據(jù)保留時(shí)間分析，推測該化合物為牡荊素（vitexin）。

圖6 成分Ⅱ的一級（A）、二級（B）質(zhì)譜及可能的結(jié)構(gòu)式（C）Fig.6 Ingredients II primary(A) , secondary(B) mass spectrogram and possible structural formula(C)

2.3.3 成分Ⅲ分析 圖7是成分III的一級二級質(zhì)譜圖和可能的結(jié)構(gòu)式。該化合物的出峰時(shí)間為6.20 min，[M-H]?為431.1007，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C21H20O10，根據(jù)二級質(zhì)譜[M-90-H]、[M-120-H]等碎片離子，該化合物的為碳苷，且含有六元糖，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，推測該化合物為異牡荊素（isovitexin）。

圖7 成分Ⅲ的一級（A）、二級（B）質(zhì)譜及可能的結(jié)構(gòu)式（C）Fig.7 Ingredients III primary(A), secondary(B), mass spectrogram and possible structural formula(C)

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，綠豆皮較強(qiáng)的抗氧化活性與其富含黃酮類化合物有關(guān)。羅磊等[9]和Kanatt等[13]的研究表明，綠豆皮比仁核具有較強(qiáng)的抗氧化性，這是由于皮殼中含有較高的黃酮類化合物。Li等[14]的研究發(fā)現(xiàn)蕎麥皮殼中含有較高的黃酮類化合物，其主要黃酮類物質(zhì)是牡荊素和異牡荊素，這兩種組分被認(rèn)為是最主要的抗氧化劑。有研究表明綠豆具有清熱解毒作用是由于其活性部位提高了機(jī)體對氧自由基的清除能力，減輕了過量的氧自由基引起的機(jī)體損傷[15?17]。本研究通過連續(xù)制備色譜分離純化得出的抗氧化活性組分經(jīng)鑒定推測出其主要含有牡荊素、異牡荊素和圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷。牡荊素和異牡荊素具有較高的抗氧化能力已被很多研究所證實(shí)，牡荊素能保護(hù)DNA氧化損傷，使細(xì)胞免受·OH誘導(dǎo)的氧化損傷，降低CSHFD小鼠肝臟脂肪沉積，減輕脂質(zhì)代謝，抑制肝臟炎癥反應(yīng)。此外，牡荊素可顯著降低肝巨噬細(xì)胞浸潤，明顯下調(diào)肝SREBP-1c、FAS、ACC mRNA和蛋白表達(dá)[18?19]。異牡荊素可通過抑制機(jī)體的氧化反應(yīng)改善順鉑誘導(dǎo)的腎損傷[20]。黃酮類化合物的B環(huán)是其清除自由基的主要活性部位，當(dāng)該環(huán)存在鄰酚羥基結(jié)構(gòu)時(shí)，抗氧化活性增強(qiáng)。潘國慶等[21]的研究表明，B環(huán)上有鄰位羥基，自由基清除能力會顯著增強(qiáng)，如槲皮素比山萘素的B環(huán)上多了一個(gè)鄰位羥基，其活力顯著增強(qiáng)。胡棟寶等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物的B環(huán)上含有鄰位羥基容易形成分子內(nèi)氫鍵，這有利于分散苯氧自由基上的單電子，此種結(jié)構(gòu)具有較高的抗氧化活性[23]。本研究推測的另外一種成分圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷的B環(huán)上有一個(gè)鄰位羥基，由此，除了牡荊素和異牡荊素這兩種抗氧化組分外，這可能是60%洗脫樣品中綠豆皮黃酮具有較強(qiáng)抗氧化能力的另外一個(gè)原因。本文對綠豆加工副產(chǎn)物中綠豆皮的黃酮類化合物進(jìn)行了提取及分離純化，鑒定出綠豆皮黃酮中具有較強(qiáng)抗氧化能力的3個(gè)組分結(jié)構(gòu)，這為綠豆加工副產(chǎn)物資源的利用提供了理論依據(jù)。