基于陽極氧化鋁比色陣列傳感器對魚肉新鮮度的測定

劉秀英，夏 菲，王佳燕，高 雪，孫小飛，李學鵬, ，勵建榮，郭曉華，于建洋

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州 121013；2.山東美佳集團有限公司，山東日照 276800；3.榮城泰祥食品股份有限公司，山東威海 264309）

近年來，隨著人們生活水平和健康意識的提高，食品的品質和安全問題逐漸成為消費者的關注熱點。魚肉自身味道鮮美，營養價值豐富，被認為是人類飲食中大量重要營養物質的來源之一，廣受消費者的青睞[1?2]。然而，由于微生物和酶的共同作用，魚在貯存過程中易腐敗變質，導致貨架期的縮短，不僅極大地降低了魚類產品的經濟價值，而且對消費者的生命安全也存在潛在危害[3]。

目前，魚肉新鮮度的評價主要依靠傳統的檢測方法，如感官評價法、理化指標法和微生物法[4?5]。該類方法可以提供準確的定量結果[6]，但檢測過程繁瑣、耗時長，會破壞魚肉的原有價值[7?9]。因此，基于傳統的檢測方法都不能滿足魚肉新鮮度的現場快速無損檢測。近年來，比色陣列傳感器因其成本低、操作簡單、響應速度快、無破壞性、靈敏度高等優點成為了監測魚肉新鮮度的一種有力工具[10?11]。如Zaragozá等[12]以氧化鋁和硅膠作為固相載體，基于5種化學響應性染料研制了一種可評估新鮮海鯛貨架期的比色陣列傳感器。Magnaghi等[13]將多種pH指示劑嵌入陰離子交換纖維素膜中，構建了一種可以監測不同魚類整腐爛過程的比色陣列傳感。Majdinasab等[14]通過在海藻酸鹽微球中包裹天然花青素提取物，開發了一種可監測虹鱒魚新鮮度的新型比色傳感器，研究結果表明該比色傳感器對魚肉貯藏過程中的pH值和揮發性胺變化非常靈敏，其微球顏色變化與TVBN和微生物數量結果一致。

比色陣列傳感器是一種新興的嗅覺可視化技術，其組成元素主要包括具有特定識別能力的光學氣敏材料和固相載體[15]。目前，用于比色陣列傳感器中的光學氣敏材料主要包括氧化還原指示劑、金屬卟啉、pH指示劑和溶劑變色染料[16?18]。其中，pH指示劑因其結構穩定、價格便宜等優點被廣泛地應用于魚肉新鮮度比色陣列傳感器的構建中。其檢測機理是，當魚肉腐敗釋放的揮發性氣體濃度足夠高時，附載在固相載體中的pH指示劑會與揮發性氣體發生反應并呈現出特定的顏色變化，最終通過區分暴露于樣品前后的傳感器陣列圖像，達到對魚肉新鮮度的可視化檢測[19?23]。固相載體是比色陣列傳感器的重要組成部分，對傳感器的性能有著重要影響。傳統的比色陣列傳感器通常以反相硅膠板、石英、玻璃等多孔膜作為固相載體[24?28]，然而這些載體都存在著制備成本高、比表面積低等缺點，導致光學氣敏材料分布不均勻，進而影響最終顏色變化不明顯的結果。近年來，陽極氧化鋁片因比表面積大，孔隙率高，背景色淺，能使光學氣敏材料分布更加均勻等優勢，成為比色陣列傳感器中較好的感官底物[29?30]。

因此，本研究采用一步陽極氧化法制備了納米多孔陽極氧化鋁片，并選取13種指示劑附著于納米多孔陽極氧化鋁片中，構建了一種高效、操作簡單、低成本的比色陣列傳感器。利用所構建的比色陣列傳感器對室溫（25 ℃）條件下的大菱鲆魚肉新鮮度進行了實時無損檢測，并結合聚類分析和主成分分析對大菱鲆的新鮮度等級進行區分。最后，將該比色陣列傳感器應用于鯉魚和美國紅魚新鮮度的檢測，以檢驗該比色傳感器對其它魚類實際樣品的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鋁片（99.99%） 冠泰金屬材料有限公司；鈦片（99.60%） 寶鈦公司；大菱鲆、美國紅魚、鯉魚 購買于遼寧省錦州市水產市場；氯酚紅、溴百里酚藍、苯酚紅、溴酚藍、中性紅、甲酚紅、無水碳酸鉀 阿拉丁試劑有限公司；溴鄰苯三酚 紅梯希愛（上海）華成工業發展有限公司；鄰苯二酚紫、磷酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；溴甲酚紫 上海三愛思試劑有限公司；溴酚紅 上海金穗生物科技有限公司；甲基紅 天津市永晟精細化工有限公司；溴甲酚綠 天津化學試劑有限公司；玫紅酸 天津市福晨化學試劑廠；無水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉 天津風船化學試劑科技有限公司；硫酸、鹽酸 錦州古城化學試劑有限公司。除中性紅和甲酚紅為化學級試劑外，其余pH指示劑均為分析級試劑。

85-2型磁力加熱攪拌器 常州榮華儀器有限公司；DP1000A型直流穩壓電源 MESTEK公司；SK 6210HP型超聲波清洗器 KUDOS公司；FA3103C型電子天平 上海天美天平儀器有限公司；E-3150型pH計 上海雷磁儀器有限公司；LRH-150型生化培養箱 上海一恒科技有限公司；S4800型掃描電子顯微鏡 荷蘭飛利浦公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 陽極氧化鋁基材的制備 陽極氧化鋁基材的制備方法參考文獻[31]并稍加改動，將鋁片依次放入無水乙醇和去離子水中超聲清洗，再置于含有0.5%氫氧化鈉、0.8%碳酸鈉和2%磷酸鈉的溶液中進行6 min超聲（240 W）脫脂處理。將脫脂后的鋁片浸泡在0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中，去除鋁片表面的天然氧化鋁。此后，將該鋁片放入15%碳酸鈉和5%磷酸鈉的混合溶液中，在60 °C、恒定電壓（5 V）下進行10 min的電化學拋光后，用去離子水徹底沖洗，得到具有較好鏡面效果的鋁片。以預處理后的鋁片為陽極，鈦片為陰極，在20 ℃，電壓15 V，180 g/L硫酸電解液中反應45 min后，用去離子水反復洗滌，室溫自然干燥，得到陽極氧化鋁片。

1.2.2 陽極氧化鋁的表征 采用S4800型掃描電子顯微鏡對陽極氧化鋁片的表面形貌結構進行了觀察，觀察前陽極氧化鋁片進行噴金處理，儀器加速電壓為5.0 kV。

1.2.3 傳感器陣列的制備 參考Huang等[15]的研究，分別選取溴甲酚綠、鄰苯二酚紫、溴酚藍、玫紅酸、溴酚紅、溴鄰苯三酚紅、苯酚紅、氯酚紅、溴百里香酚藍、甲酚紅、溴甲酚紫、中性紅、甲基紅13種指示劑構建傳感器陣列。以陽極氧化鋁片為基材，采用浸染吸附的方法對指示劑進行固定，制備13個陣列點。將裁剪好的13張氧化鋁片分別浸泡到濃度為0.5 mg/mL的溴甲酚綠和溴酚藍溶液；1 mg/mL的溴鄰苯三酚紅、鄰苯二酚紫、溴甲酚紫、甲酚紅溶液；2 mg/mL 的溴酚紅、甲基紅、玫紅酸、氯酚紅、溴百里香酚藍、苯酚紅和中性紅乙醇溶液中，12 h后，取出氧化鋁片，室溫下自然干燥。將干燥后的13個氧化鋁片逐個粘貼到半徑為500 mm的圓形孔的模具上，形成排列整齊的比色陣列傳感器。

1.2.4 樣品預處理 大菱鲆、美國紅魚、鯉魚經宰殺，去除魚的頭、尾、皮及內臟后，將剩余的每種新鮮魚肉平均分成兩份，分別用于揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的測定以及比色陣列傳感器對魚新鮮度的測定。

1.2.5 揮發性鹽基氮的測定 TVB-N的測定方法主要參考國家標準 GB/T-5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》中規定的微量擴散法[32]。每個樣品三個平行，取平均值進行結果分析。

1.2.6 比色陣列傳感器對魚新鮮度的測定 將制備好的傳感陣列置于放有新鮮魚肉的托盤中，用保鮮薄膜密封，在25 ℃恒溫下貯藏，并每隔2 h用智能手機拍照，采集傳感器圖像。所有樣品均一式三份。

1.3 數據處理

采用Excel和Origin 2018進行數據整理與分析，運用Photoshop提取傳感陣列圖像的RGB值，比較各陣列點變色前后的RGB值，得到不同貯藏時間下傳感陣列顏色變化的差譜圖，利用Image J軟件提取差譜圖中的特征矩陣，并結合Minitab19進行層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）。運用SPSS軟件進行差異顯著性分析，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 陽極氧化鋁的表征

為了比較氧化處理前的鋁片、氧化處理后和固定指示劑后的氧化鋁片在微觀結構上的區別，研究中還分別對以上三種材料進行了掃描電子顯微鏡分析。圖1和圖2分別為鋁片陽極氧化處理前后和固定了溴甲酚綠指示劑后的氧化鋁陣列點（以下簡稱溴甲酚綠陣列點）的掃描電鏡微觀結構圖。由圖1（a）與圖1（b）對比可知，未經氧化的鋁片表面較平整，經過陽極氧化處理后，鋁片表面形成許多形狀不規則的孔洞。與鋁片相比，陽極氧化鋁片具有較大的表面積，有助于進一步對傳感指示劑進行附著與固定。圖2為固定了溴甲酚綠指示劑后的陽極氧化鋁陣列點的微觀形貌。從圖中可以看出，陣列點的結構仍呈現為不規則的孔洞，這說明溴甲酚綠指示劑的固定并沒有對陽極氧化鋁片的結構造成破壞。此外，研究中還對除溴甲酚綠以外的其它指示劑處理后的陣列點的微觀結構進行觀察，結果發現其微觀結構與固定溴甲酚綠后的陣列點均相同。該結構將在一定程度上增加了指示劑與待測氣體之間的接觸面積，有利于提高相互作用效率。

圖1 鋁片陽極氧化處理前后的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope of aluminum sheet before and after anodizing treatment

圖2 溴甲酚綠陣列點的掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of bromocresol green array points

2.2 傳感器陣列在魚類樣品中的應用

2.2.1 TVB-N的測定 TVB-N是指在酶和微生物的作用下，動物性食品在腐敗過程中蛋白質分解而產生氨以及胺類等堿性含氮物質。該指標是反映原料魚和肉的鮮度的主要指標。我國國家標準根據TVB-N含量將海水魚的新鮮度分為三個等級。當TVB-N含量低于15 mg/100 g時，海水魚為新鮮級；當TVB-N的范圍在15~30 mg/100 g時，海水魚為次新鮮級；當其含量超過30 mg/100 g時，海水魚為腐敗級[33]。圖3顯示了大菱鲆在貯藏過程中TVB-N含量的變化趨勢，TVB-N含量隨著貯藏時間的延長而逐漸增加。鮮活的大菱鲆經宰殺處理后，測得的TVB-N初始值為6.55 mg/100 g。隨著貯藏時間的延長，可以看出TVB-N的含量呈現出先緩慢上升進而迅速上升的趨勢。當貯藏時間達到第12 h時，TVB-N值增加到15.23 mg/100 g，因此12 h為魚肉從新鮮等級降為次新鮮等級的臨界點。當貯藏時間超過12 h后，由于微生物的快速生長，TVB-N含量大幅度增加。當貯藏時間達到第22 h時，TVB-N值高達32.85 mg/100 g，超過規定可食用魚類TVB-N的臨界值，魚肉發生腐敗變質，不可食用。

圖3 TVB-N隨貯藏時間的變化趨勢Fig.3 Variation trend of TVB-N with storage time

2.2.2 差譜圖響應分析 圖4為比色傳感陣列對不同貯藏時間大菱鲆魚肉新鮮度的響應。從差譜圖中可以看出，隨著貯藏時間的延長，陣列上各個陣列點逐漸產生響應，顏色變化用肉眼即可識別。當貯藏時間低于12 h時，傳感陣列上的十三個陣列點并未完全發生響應，此時的TVB-N含量低于15 mg/100 g，魚肉樣品仍處于新鮮狀態。當貯藏時間達到12 h時，TVB-N含量超過新鮮等級魚肉的最大限值，魚樣變為次新鮮等級，此時傳感器中的所有陣列點均顯現出肉眼可見的顏色。隨著時間的延長，魚樣品質逐漸發生變化，TVB-N含量迅速增加。在貯藏時間達到第20 h時，TVB-N含量增加到28.33 mg/100 g，臨近次新鮮產品的閾值30 mg/100 g。此時，差譜圖中溴甲酚綠、溴酚藍、氯酚紅、中性紅和甲基紅陣列點分別變為粉紅色、藍色、橙色、深灰色和藍綠色。當貯藏時間延長到第22 h時，TVB-N含量達到32.85 mg/100 g，魚肉發生腐敗，此時差譜圖中的溴甲酚藍、溴甲酚紅、氯酚紅和中性紅分別變為紫、棕、黃、藍綠色。以上信息表明，陣列點肉眼可見的顏色變化與大菱鲆的品質變化過程密切相關。因此，將該比色陣列傳感器應用于大菱鲆新鮮度的檢測具有可行性。

圖4 室溫下大菱鲆在不同貯藏時間段的比色陣列差譜圖Fig.4 Difference spectrum of colorimetric array of turbot at different storage periods at room temperature

2.2.3 多變量分析 為進一步驗證比色陣列傳感器對魚新鮮度的定量分析能力，在收集到的39維RGB顏色空間響應數據（13種pH染料×ΔR，ΔG，ΔB，13×3）的3個顏色分量基礎上，用Image J提取差譜圖輸出的特征矩陣進行HCA和PCA分析。

2.2.3.1 HCA分析 HCA是根據樣品數據在全維空間中的向量間距離對分析向量進行分組的一種標準統計程序[34]。相似度高的數據被聚類到一組，不同數據之間的相似度越低，聚類分析圖上的距離越遠。由圖5可知，相同貯藏時間的平行樣品發生聚集，不同貯存時間的樣品間沒有發生交叉重疊，證明了該比色陣列較好的穩定性。此外，HCA結果從左到右可以依次劃分為三個區間：貯藏時間0~10 h為第一組，此時魚的等級為新鮮；貯藏時間12~22 h為第二組，此時魚的等級為次級新鮮；貯藏時間24~28 h為第三組，此時魚的等級為腐敗。綜上，該比色陣列傳感器可以很好地區分不同貯藏時間的魚肉。

圖5 不同貯藏時間的大菱鲆樣品的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of turbot samples with different storage time

2.2.3.2 PCA分析 PCA可通過三維主成分散點分布圖呈現出不同新鮮度大菱鲆的聚類趨勢。如圖6（a）所示，第一主成分的貢獻率為50.33%，第二主成分的貢獻率為12.77%，第三主成分的貢獻率為9.48%，累計貢獻率72.58%。由此可見，前三個主成分足以表征樣本的大部分信息。此外，從圖中的樣品分布趨勢看出，不同貯藏時間的大菱鲆呈現出不同聚類趨勢，聚類結果可以清晰地分為3個組別：2~10 h，新鮮組；12~20 h，次新鮮組；22~28 h，腐敗組，這一結果與2.2.1中的TVB-N分析結果一致。但是，當貯藏時間為4~10 h時，樣本間存在明顯的交集區域。因此，我們將4~10 h范圍內的樣本投影到第一主成分和第三主成分中，得到圖6（b）。觀察到，4~10 h之間的樣品實際上沒有發生重疊。綜上所述，PCA方法可以較好地區分不同貯藏時間的大菱鲆新鮮度，同時這也證明了本研究所制備的比色陣列傳感器應用于魚新鮮度的指示具有可行性。

圖6 不同新鮮度大菱鲆的主成分散點分布圖Fig.6 Three-dimensional principal component distribution maps of turbot with different freshness

2.3 比色傳感器在魚類實際樣品中的應用

為進一步檢驗比色陣列傳感器在其它魚類實際應用中的準確性，對不同貯藏時間下的鯉魚新鮮度進行了檢測。圖7a為鯉魚貯藏16 h時的陣列響應結果，此時托盤內傳感陣列顏色處于比色陣列差譜圖中次新鮮級范圍，通過與差譜圖比較可知，托盤內傳感陣列的顯色結果與TNB-N含量為16.20 mg/100 g時的陣列響應結果幾乎一致，因此初步推斷貯藏16 h時的鯉魚處于次新鮮狀態，預測此時鯉魚的TVB-N值為16.20 mg/100 g。為進一步驗證推斷的準確性，實驗同時測定了16 h時的實際TVB-N值，將預測的TVB-N值與實際測得的TVB-N值進行差異顯著性分析，結果如表1所示，16 h的預測TVB-N值與實際TVB-N值差異性不顯著（P>0.05），說明檢測結果準確。此外，對貯藏18 h時的鯉魚進行了同樣的驗證比較，所測得的陣列傳感圖見圖7b。通過測得譜圖與標準差譜圖的比較，預測貯藏18 h時的TVB-N值為18.25 mg/100 g，與實際測定TVB-N值進行差異分析后，發現二者沒有顯著性差異（P>0.05），檢測結果準確。由此可以證明，本研究的比色陣列傳感器可以適用于不同淡水魚新鮮度的檢測，且檢驗結果具有良好的準確性。

表1 不同實際魚類樣品的預測TVB-N值與實際TVB-N值的顯著性差異分析Table 1 Significant difference analysis between predicted TVB-N value and actual TVB-N value of different actual fish samples

除了在淡水魚中進行了驗證，研究中還對海水魚的新鮮度監測進行了驗證。以美國紅魚為代表，對不同貯藏時間下的美國紅魚傳感陣列圖進行數據處理得到圖7c和圖7d。在貯藏時間為20 h時，TVB-N預測值為22.84 mg/100 g，實際值為21.27 mg/100 g，二者差異不顯著；在貯藏時間為24 h時，TVB-N預測值為28.33 mg/100 g，實際值為29.11 mg/100 g，二者差異不顯著。

圖7 比色陣列傳感器對不同貯藏時間下的鯉魚和美國紅魚產生的響應結果Fig.7 Response results of the colorimetric sensor array to common carp and American red fish under different storage time and the standard deviation spectrum

綜上所述，本研究所構建的傳感陣列與魚的不同新鮮度之間建立了一種通用的顯色關系，即通過比色陣列點的顏色顯現結果與標準差譜圖的對比就可以簡單準確地判別魚類的新鮮度。

為了更加準確地驗證比色傳感器對魚樣新鮮程度的識別能力，將傳感器陣列點的響應信息特征值（每個點的R、G、B值和歐氏距離）帶入大菱鲆標準差譜圖特征矩陣中進行HCA分析。將16和18 h下鯉魚的陣列響應信息帶入大菱鲆標準差譜圖特征矩陣，結果如圖8所示。由圖可得，貯藏16和18 h的鯉魚在聚類過程中沒有出現錯誤分類，分別與貯藏14和16 h的大菱鲆歸類為次新鮮度等級。由此說明本研究制備的比色傳感器對魚類新鮮度具有良好的識別能力。

圖8 實際樣品的聚類分析Fig.8 Cluster analysis of real samples

將貯藏20和24 h下美國紅魚的陣列響應信息帶入大菱鲆標準差譜圖特征矩陣進行聚類分析，結果如圖9所示。由圖可以發現，貯藏20 和24 h的美國紅魚在聚類過程中同樣沒有出現錯誤分類，分別與貯藏18和20 h的大菱鲆歸類為次新鮮度等級。因此可以得出，通過本研究所制備的比色傳感器用于魚類新鮮度的檢測具有可行性，對于不同魚類新鮮度的識別具有正確的判別能力。

圖9 實際樣品的聚類分析Fig.9 Cluster analysis of real samples

3 結論

本文以陽極氧化鋁片為基材，結合13種指示劑，開發了一種新型的可視化比色陣列傳感器，應用于大菱鲆魚肉新鮮度的檢測。根據差譜圖的顏色變化，用肉眼即可隨不同貯藏時間的魚肉進行新鮮度判別。當傳感陣列上的十三個陣列點并未完全發生響應，表明魚肉屬于新鮮等級；當差譜圖中的溴甲酚藍、溴甲酚紅、氯酚紅和中性紅分別變為紫、棕、黃、藍綠色時，表明魚肉已經腐敗變質。HCA和PCA分析結果也證明了該陣列可用于對不同貯藏時間的魚肉樣品新鮮度的測定。此外，為檢驗比色傳感器對其它魚類實際樣品的檢測效果，將該陣列應用于不同貯藏時間下鯉魚和美國紅魚新鮮度的檢測。結果表明，通過傳感器陣列預測的TVB-N值與實際TNB-N值無顯著性差異，對于不同魚類新鮮度的識別具有正確的判別能力。綜上所述，該比色陣列傳感器能夠通過肉眼快速、準確地識別不同實際魚類的新鮮度。