糞便HMGB1、AI-2和HBD2在新生兒壞死性小腸結腸炎中的臨床意義及與腸道菌群的關系*

冉亞林，蔣秋容

1.重慶市大渡口區人民醫院兒科，重慶 400084；2.陸軍軍醫大學第一附屬醫院輸血科，重慶 400038

新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)可較為迅速地進展為腸壞死、腸穿孔和多器官衰竭，甚至導致新生兒死亡[1]。現階段臨床診斷NEC的方法主要包括影像學和血液學指標，但因病情進展迅速，當影像學顯示腸壁異常、門靜脈積氣、腸袢固定、氣腹和腹腔積液時，NEC往往已經處于危重期。新生兒反復的靜脈穿刺操作難度較大[2-3]，而糞便檢測指標具有便捷、快速、對新生兒影響小和可多次檢測的特點，尋找可以在疾病早期診斷NEC和判斷病情的糞便指標，具有重要的臨床意義。

高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可被腸道中的炎性細胞和壞死的上皮細胞表達并分泌，從而在糞便中被檢測到，最新研究發現，HMGB1水平在NEC患兒糞便中升高[4]。自誘導分子-2(AI-2)具有在細菌之間傳遞信息的作用，并參與腸組織的炎性反應[5]。人β-防御素2(HBD2)主要由與外界接觸的黏膜細胞表達，包括腸黏膜細胞，其具有殺傷細菌和免疫趨化的作用，研究已經發現，其在NEC患兒體內異常表達[6]，但是其在NEC中的臨床意義尚不清楚。因此，本研究主要分析糞便HMGB1、AI-2和HBD2在NEC中的臨床意義，以及它們與腸道菌群間的關系，為臨床更好地診斷NEC提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2019年9月重慶市大渡口區人民醫院收治的105例NEC患兒作為NEC組，以及同期出生的50例健康新生兒作為對照組。2組患兒的一般情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究符合赫爾辛基宣言，獲得重慶市大渡口區人民醫院醫學倫理委員會批準，受試新生兒家長知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組新生兒一般資料比較

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)日齡2～10 d；(2)經組織學、影像學等檢查，符合NEC的診斷標準[7]；(3)患兒臨床資料齊全。排除標準：(1)合并獲得性免疫缺陷綜合征、血液性疾病、免疫疾病等患兒；(2)合并惡性腫瘤等患兒。

1.3方法

1.3.1糞便標本的采集及檢測 采集健康新生兒出生2～10 d的糞便標本，以及NEC患兒確診入院時(急性期)和病情好轉且母乳喂養3 d后(恢復期)的糞便標本。采用酶聯免疫吸附試驗(試劑盒由上海研謹生物科技有限公司提供)檢測糞便中HMGB1和HBD2水平，根據試劑盒說明書的方法，分別加入抗體的顯色劑，終止顯色后使用酶標儀(美國Thermo公司)檢測450 nm波長處的吸光度值，根據標準曲線計算HMGB1和HBD2水平(每克糞便的含量)。采用化學發光法檢測糞便標本的AI-2水平，將40 mg糞便標本與1.5 mL的AI-2專業培養基哈維弧菌BB 170(ATCC?14126，美國ATCC公司)混合，在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min，收集上清液，然后接種到培養基中孵育過夜。然后使用酶標儀檢測糞便標本的生物發光值，以1 μmol/L的AI-2溶液(美國Sigma公司)作為對照，標本檢測值的百分比數值即為AI-2水平。

1.3.2NEC患兒病情及腸道菌群紊亂程度評估 使用改良Bell-NEC分期標準[8]，根據患兒全身癥狀、胃腸道癥狀、影像學檢查結果及治療情況，對患兒的病情和預后進行分級評估，Ⅰ級和Ⅱa為輕度NEC，Ⅱb和Ⅲ級為重度NEC。所有患兒在確診當日采集糞便標本，并立即進行檢測，根據《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》[9]將腸道菌群紊亂程度分為4個等級：(1)基本正常，糞便標本細菌總數處于正常值范圍,革蘭陽性菌數大于革蘭陰性菌數,革蘭陽性或陰性球菌少見;(2)Ⅰ度失調，糞便標本細菌總數略低于正常值,革蘭陽性菌數小于革蘭陰性菌數,革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌增多;(3)Ⅱ度失調，糞便標本細菌總數明顯低于正常值,革蘭陰性桿菌總數增多,革蘭陽性球菌數目較多,有少量酵母樣菌;(4)Ⅲ度失調，糞便標本細菌總數極少,未見或很少見革蘭陽性或陰性桿菌,酵母樣菌比例較多。分級越高，腸道菌群紊亂程度越嚴重。

2 結 果

2.1對照組及急性期不同病情嚴重程度NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較 根據Bell-NEC分期，NEC患兒分為輕度NEC組54例，重度NEC組患兒51例。對照組、輕度NEC組、重度NEC組HMGB1、AI-2和HBD2水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，NEC組糞便HMGB1水平升高，AI-2和HBD2水平降低，且重度NEC組HMGB1水平高于輕度NEC組，AI-2和HBD2水平低于輕度NEC組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 對照組和不同病情嚴重程度急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較

2.2急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平與NEC病情嚴重程度的相關性 Spearman相關分析結果顯示，糞便HMGB1水平與NEC病情嚴重程度呈正相關(r=0.412，P<0.05)，AI-2和HBD2水平與NEC病情嚴重程度均呈負相關(r=-0.405、-0.381，P<0.05)。

2.3對照組及不同NEC時期患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較 對照組、急性期、恢復期HMGB1、AI-2和HBD2水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，急性期和恢復期HMGB1水平升高，且恢復期低于急性期(P<0.05)；急性期AI-2水平低于對照組及恢復期，且恢復期高于對照組(P<0.05)；急性期和恢復期HBD2水平低于對照組，且恢復期高于急性期(P<0.05)，見表3。

表3 對照組及不同NEC分期患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較

2.4對照組及不同腸道菌群紊亂程度急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較 對照組及不同腸道菌群紊亂程度的NEC患兒急性期糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組糞便HMGB1水平<Ⅰ度失調組<Ⅱ度失調組<Ⅲ度失調組(P<0.05)，而對照組AI-2和HBD2水平>Ⅰ度失調組>Ⅱ度失調組>Ⅲ度失調組(P<0.05)，見表4。

表4 對照組及不同腸道菌群紊亂程度NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平比較

2.5急性期NEC患兒糞便HMGB1、AI-2和HBD2水平與腸道菌群紊亂程度的相關性 Spearman相關分析結果顯示，HMGB1水平與腸道菌群紊亂程度呈正相關(r=0.368，P<0.05)，AI-2和HBD2水平與腸道菌群紊亂程度均呈負相關(r=-0.432、-0.406，P<0.05)。

3 討 論

NEC的臨床表現主要為腹脹、嘔吐和便血，但目前尚不清楚其確切病因，且發病率和病死率始終較高。據報道，在新生兒重癥監護室，NEC的發病率為2%～5%，其中極低出生體質量兒發病率為4.5%～8.7%，病死率為20%～30%，超低出生體質量兒病死率則高達30.0%～50.9%[10-12]。臨床研究發現，NEC的危險因素包括早產和低出生體質量狀態、腸和免疫系統的發育不成熟，以及配方奶喂養等[13]。此外，最新研究結果顯示，腸道菌群失調也與NEC密切相關[14]，益生菌的破壞和潛在致病菌的過度生長是早產兒NEC發生的重要原因[15-16]。但腸道菌群培養需要的時間較長，無法對患兒的早期治療提供指導作用，而二代測序技術又較為昂貴，應用有限。為此，本研究旨在尋找可有效反映NEC病情和判斷腸道菌群失調情況的簡便、經濟、快捷的臨床檢測指標。

HMGB1是一種從受損細胞中釋放的DNA結合蛋白，具有類似炎癥細胞因子的特性，并且可以由巨噬細胞分泌，也可以由受損的腸黏膜上皮細胞分泌[17]。HMGB1不但可反映炎癥的嚴重程度，還可通過激活Toll樣受體4相關通路削弱腸道上皮細胞的遷移和黏附，阻礙組織修復[18]，而這會進一步引起腸黏膜屏障受損，導致腸道菌群入侵和異常繁殖[19]。本研究結果顯示，NEC患兒糞便中HMGB1水平明顯升高(P>0.05)，且與病情嚴重程度呈正相關(r=0.412，P<0.05)，而隨著疾病的控制，HMGB1水平則逐漸降低(P>0.05)。本研究結果還顯示，HMGB1與腸道菌群紊亂程度有關(r=0.368，P<0.05)。羅若谷等[20]的研究顯示，糞便中HMGB1水平升高，且可作為早期診斷NEC的指標，但該研究未分析其與NEC病情的關系。在成人潰瘍性結腸炎中，糞便中HMGB1水平升高預示著病情加重[21]，這提示在NEC患兒中，糞便中HMGB1水平升高可能反映腸道上皮組織出現嚴重的炎性反應，腸黏膜組織受損且組織修復能力受阻，并且可反映腸道菌群紊亂程度，而隨著病情的改善，腸道細胞損傷降低，且炎性反應得到緩解，從而使HMGB1水平降低。因此，HMGB1水平可作為早期判斷NEC患兒病情和腸道菌群紊亂程度的指標，并且其水平降低可能提示病情好轉。

腸道菌群紊亂與機體的免疫炎性反應有關，近年來的研究結果顯示其參與了NEC的發病進程，擬桿菌門/屬細菌水平的失調是誘發NEC的高危因素，并且腸道菌群紊亂程度也與NEC病情具有相關性[15]。HBD2由腸道細胞分泌，不但可以調控免疫反應，還具有抑制細菌過度繁殖和調控菌群平衡作用[22]。AI-2是革蘭陰性或者陽性菌群之間交流的信號，當AI-2水平降低時，細菌過度繁殖，有研究結果顯示糞便AI-2作為腸道菌群標志物的應用，但其在NEC中的臨床意義仍不清楚[23]。本研究結果顯示，急性期NEC患兒糞便中HBD2和AI-2水平明顯降低(P<0.05)，且與病情嚴重程度呈負相關(r=-0.405、-0.381，P<0.05)，而隨著疾病的控制，HBD2和AI-2水平逐漸升高，其中AI-2水平高于健康新生兒(P<0.05)。此外，本研究結果還顯示，HBD2和AI-2水平降低與NEC患兒腸道菌群失衡嚴重程度有關(r=-0.432、-0.406，P<0.05。實驗證實，結腸炎模型小鼠結腸黏膜中的HBD2水平降低，而病情得到緩解后腸黏膜中表達的HBD2水平明顯升高[24]。王雨等[25]的研究結果顯示，當腸黏膜細胞受損后，HBD2水平降低，會引起腸道菌群異常。最新研究結果也顯示，在NEC患兒恢復期，糞便中AI-2水平會明顯升高，這期間雖然腸道菌群可能仍舊異常，但病情正在好轉[26]。這提示腸黏膜損傷導致的HBD2和AI-2表達水平降低，會促進腸黏膜細菌的過度繁殖，進而參與NEC的進展，而菌群過度繁殖也會進一步損傷腸黏膜。在NEC恢復過程中，腸黏膜修復促進HBD2的表達，AI-2水平升高也會進一步調控菌群平衡。因此，糞便中HBD2和AI-2水平可作為反映NEC病情和腸道菌群紊亂的指標，并且其水平升高提示腸黏膜的修復和腸道菌群平衡趨于正常，預示著NEC病情的好轉。通過及時檢測糞便HMGB1、HBD2和AI-2水平，不但有助于在早期評估NEC病情，還可判斷疾病的改善情況，具有便捷、經濟的優點。然而，關于HMGB1、HBD2和AI-2在NEC病情和預后中的診斷與臨床價值，仍需要擴大樣本量進行研究，其參與NEC的機制仍需要深入探究。

綜上所述，糞便HMGB1、HBD2和AI-2水平與NEC的病情嚴重程度有關，且可以反映腸道菌群紊亂情況，而HMGB1水平的降低，及HBD2、AI-2水平的升高預示著腸黏膜組織的修復和菌群過度繁殖狀況得到抑制。