AHSG與CEA聯合檢測對膀胱癌的診斷價值*

劉牟林，丁大朋

大連醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧大連 116011

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率呈逐年上升趨勢，是危害人類身心健康的主要疾病之一[1-2]。膀胱癌患者早期臨床表現多為尿頻、尿急等非特異性癥狀，導致臨床漏診率和誤診率較高。目前，膀胱鏡檢查與組織活檢是診斷膀胱癌的金標準[3-4]，但以上方法為侵入性的有創檢查手段，很多患者對其心理接受度低且要承受更多痛苦，加上較高的經濟成本和尿路感染、出血等風險，使其無法成為常規篩查方法。血液作為無創類檢查標本，可以提供DNA、RNA和蛋白質等來源信息，是尋找腫瘤標志物的理想標本。血液檢查具有標本用量少、易取得且創傷小、患者易接受等優點[5]。本研究利用在線腫瘤數據庫starBase和Oncomine分析血清胎球蛋白A(AHSG)在膀胱癌中的mRNA表達情況，并采用Human Protein Atlas(HPA)數據庫和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)驗證AHSG在膀胱癌組織中的蛋白表達水平。同時，利用受試者工作特征(ROC)曲線分析AHSG與CEA聯合檢測對膀胱癌的診斷價值，為膀胱癌篩查提供新的、潛在的客觀評價指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2019年9月就診于本院的膀胱癌患者30例作為膀胱癌組，其中男24例、女6例，年齡41～83歲、平均(64.9±11.27)歲。入選標準：(1)年齡大于18歲；(2)病理檢查明確診斷為膀胱癌；(3)未接受手術、放化療等治療。排除標準：患有急性或慢性感染及其他膀胱相關疾病者。選擇本院同期30例體檢健康者作為健康組，健康組年齡和性別與膀胱癌組患者相匹配，各項生化指標正常，無膀胱癌家族史且無重要臟器疾病與惡性腫瘤。本研究通過本院倫理委員會批準(YJ-KY-SB-2017-50)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 北京威士達公司SunriseTM酶標儀，羅氏Cobas e601全自動化學發光免疫分析儀，美國P&D公司人AHSG ELISA試劑盒。

1.3方法

1.3.1在線腫瘤數據庫分析AHSG mRNA及蛋白的表達水平 在starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)數據庫中的“Pan-Cancer”模塊中選擇“Gene Differential Expression”，在“Gene”選項中輸入“AHSG”，得到AHSG在各種腫瘤中的表達數據，選擇“BLCA(Bladder Urothelial Carcinoma)”得到AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達數據，mRNA表達水平由RNA-seq數據通過log2(FPKM+0.01)獲得。

在Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)數據庫的“Search”選項中輸入“AHSG”，在“Analysis Type”選項中的“Cancer vs. Normal Analysis”下選擇“Bladder Cancer vs. Normal Analysis”，“THRESHOLD BY：P-VALUE”選擇“0.05”，得到AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達數據。

在HPA(https://www.proteinatlas.org/)數據庫的“Search”選項中輸入“AHSG”，點擊“TISSUE”中的“Urinary bladder”得到AHSG蛋白在正常膀胱組織中的表達結果；點擊“PATHOLOGY”中的“Urothelial cancer”得到AHSG蛋白在膀胱癌組織中的表達結果。

1.3.2在線腫瘤數據庫分析AHSG預測膀胱癌患者預后的價值 在Kaplan-Meier Plotter(KM Plotter，http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)數據庫中選擇“Start KM Plotter for pan-cancer”，在“Gene symbol”選項中輸入“AHSG”，在“Survival”選項中選擇“OS(n=7 462)”，在“Select all(n=7 489)”選項中選擇“Bladder Carcinoma”，點擊“Draw Kaplan-Meier plot”，得到AHSG預測膀胱癌患者總體生存概率的生存曲線；在“Survival”選項中選擇“RFS(n=4 420)”，在“Select all(n=7 489)”選項中選擇“Bladder Carcinoma”，點擊“Draw Kaplan-Meier plot”，得到AHSG預測膀胱癌患者無復發生存概率的生存曲線。

1.3.3血清標本采集與儲存 采集受試者清晨空腹靜脈全血3～5 mL，置于10 mL含促凝劑的真空采血管中，室溫下垂直靜置1 h，使血液充分凝固。然后將標本以3 000 r/min離心10 min，充分分離血清，取上層血清分裝于2.0 mL凍存管中，-80 ℃保存備用。

1.3.4血清AHSG和CEA水平檢測 利用ELISA商品化試劑盒檢測受試者血清AHSG水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，利用SunriseTM酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，根據標準曲線法計算血清AHSG水平并進行統計分析。利用羅氏Cobas e601全自動化學發光免疫分析儀檢測血清CEA水平，檢測過程嚴格按照儀器操作規程進行。

2 結 果

2.1AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達水平升高 利用starBase(圖1A)和Oncomine(圖1B、C)數據庫分析AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達情況，結果發現，膀胱癌組織中AHSG mRNA表達水平明顯升高，且與腫瘤分級(圖1D)高低、有無遠處轉移(圖1E)和淋巴結轉移(圖1F)密切相關(P<0.05)。當膀胱癌患者腫瘤分級越高、伴有遠處轉移或淋巴結轉移時，AHSG的表達也隨之升高。

注：A為starBase數據庫分析AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達情況；B、C為Oncomine數據庫分析AHSG mRNA在膀胱癌中的表達情況；D、E、F分別為Oncomine數據庫分析不同腫瘤分級、有無遠處轉移和有無淋巴結轉移膀胱癌的AHSG mRNA表達情況。圖1 starBase和Oncomine數據庫分析AHSG mRNA在膀胱癌組織中的表達情況

2.2AHSG是預測膀胱癌患者預后的潛在標志物 利用HPA數據庫驗證AHSG蛋白在膀胱癌組織中的表達情況，結果發現，與正常膀胱組織相比，膀胱癌組織中AHSG蛋白表達水平更高(圖2)。ELISA發現，本研究中膀胱癌組血清AHSG水平較健康組明顯升高(P<0.05)，見圖3A。KM Plotter數據庫分析發現，AHSG高表達的膀胱癌患者較AHSG低表達的患者具有更高的無復發生存概率(P<0.05)，表明AHSG是潛在的膀胱癌患者預后分析的客觀評價標志物，見圖3B、C。

注：A、B分別為HPA數據庫分析AHSG蛋白在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達情況。圖2 HPA數據庫驗證AHSG蛋白在膀胱癌組織中的表達情況

注：A為本研究膀胱癌組與健康組血清AHSG水平比較；B、C分別為KM Plotter數據庫分析AHSG預測膀胱癌患者總體生存概率和無復發生存概率的生存曲線。與健康組比較，***P<0.001。圖3 膀胱癌患者血清AHSG水平及其預后預測價值分析

2.3AHSG、CEA檢測對膀胱癌的診斷效能分析 為分析AHSG與CEA聯合檢測對膀胱癌的診斷價值，本研究首先驗證了膀胱癌組患者血清CEA水平高于健康組(P<0.05)，見圖4。同時，ROC曲線(圖5)顯示，AHSG單獨檢測診斷膀胱癌的AUC為0.855，靈敏度為66.7%，特異度為86.7%；CEA單獨檢測診斷膀胱癌的AUC為0.851，靈敏度為93.3%，特異度為70.0%。與AHSG相比，CEA檢測診斷膀胱癌的靈敏度(93.3%)較AHSG(66.7%)高，特異度(70.0%)較AHSG(86.7%)稍有降低，但降低幅度小。當AHSG與CEA聯合檢測診斷膀胱癌時，AUC為0.952，靈敏度為90.0%，特異度為93.3%，其診斷價值優于AHSG、CEA單獨檢測。

注：與健康組比較，***P<0.001。圖4 健康組與膀胱癌組血清CEA水平比較

圖5 AHSG、CEA診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討 論

膀胱癌起病隱匿，惡性程度高，手術是目前臨床上治療膀胱癌的首選方案，但患者術后生存率較低，其中轉移性膀胱癌患者的5年生存率僅為6%[6]。早期發現是膀胱癌診斷、治療和預后的關鍵。膀胱鏡檢查與組織活檢是傳統的診斷膀胱癌的有效方法，但其操作復雜，對患者損傷大，難以成為膀胱癌篩查和常規檢測的手段。因此，尋找和發現有效的血清學標志物來提高膀胱癌的臨床診斷率具有重要意義。近年來，血清蛋白質組學已成為發現腫瘤標志物的重要手段，且已證實血清標志物具有較高的靈敏度和特異度[7-10]。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是臨床上檢測血液、體液等標本的成熟質譜技術，具有操作簡便、檢測快速、高選擇性、高靈敏度和高特異性等特點。鄭愛文等[11]利用MALDI-TOF-MS檢測了子宮內膜癌患者和健康女性的血清多肽譜，發現12個差異多肽峰，其中質荷比(m/z)為2 768.0、3 402.0和6 441.0的3種血清多肽聯合診斷子宮內膜癌的靈敏度為88.1%，特異度為75.8%，鑒別子宮內膜癌和子宮良性病變的靈敏度為94.9%，能較準確地區分子宮內膜癌患者、健康女性和子宮良性病變患者，有助于子宮內膜癌的早期篩查。本研究前期利用MALDI-TOF-MS篩選并驗證了膀胱癌患者血清中5種表達上調的差異血清多肽(m/z為2 081.0、3 938.3、1 954.0、4 268.8和3 946.5)，通過納米級液相色譜耦合串聯質譜技術進行鑒定，并與UniProt數據庫比對，確定了其中2種血清多肽對應的蛋白，分別是m/z為2 018.0對應的AHSG和m/z為1 954.9對應的血清轉鐵蛋白(TRF)[12]。

AHSG是一種可分泌到體液中的蛋白質。研究發現，AHSG可以作為多種腫瘤如口腔鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌和胃癌等的標志物。JAIN等[13]利用液相色譜儀-質譜儀(LC-MS)分析，發現AHSG在口腔鱗狀細胞癌中表達升高，其診斷口腔鱗狀細胞癌的靈敏度為78.0%，特異度為87.5%，是口腔鱗狀細胞癌輔助診斷的潛在標志物。SHI等[14]分析了32例胃癌患者和30例健康對照者血清標本中AHSG的蛋白表達變化，并利用ELISA驗證差異纖維蛋白原ɑ鏈、AHSG和載脂蛋白A-I水平，發現它們在胃癌患者中表達水平升高，且具有良好的診斷價值，可成為診斷胃癌的潛在血清學標志物。目前，較少見AHSG在膀胱癌中表達水平的研究。根據前期研究結果，本研究選擇AHSG進行后續驗證和研究。首先利用starBase和Oncomine數據庫分析確定了AHSG mRNA在膀胱癌中高表達，且與膀胱癌的腫瘤分級高低、有無遠處轉移和淋巴結轉移密切相關。同時HPA數據庫和ELISA也驗證了AHSG蛋白在膀胱癌中的高表達。KM Plotter數據庫分析發現，與AHSG低表達的膀胱癌患者相比，AHSG高表達膀胱癌患者具有更高的無復發生存概率。ROC曲線顯示，AHSG單獨檢測診斷膀胱癌的AUC為0.855，靈敏度為66.7%，特異度為86.7%，表明AHSG是膀胱癌診斷和預后分析的潛在血清學標志物。

目前，膀胱癌缺乏特異的血清學腫瘤標志物，主要通過檢測CEA水平來監測患者病情變化[15]。CEA是由黏膜上皮細胞分泌的可溶性跨膜糖蛋白，在健康人群血清中含量極低，是高效、廣譜的腫瘤標志物。血清或尿CEA檢測在膀胱癌的診斷和監測中具有重要的應用價值。正常情況下，機體內CEA水平低于10 ng/mL。當膀胱組織癌變或腫瘤復發時，尿CEA水平會快速升高，其與腫瘤大小和病情嚴重程度密切相關，是膀胱癌診斷和預后評估的有效指標[16]。AHMADI等[17]發現，膀胱癌患者術前血清CEA和糖類抗原(CA)19-9水平升高，是判斷患者預后不良的獨立預測因子。本研究驗證了膀胱癌患者血清CEA水平升高，并利用ROC曲線分析AHSG、CEA對膀胱癌的診斷價值，發現AHSG與CEA聯合檢測診斷膀胱癌的AUC為0.952，較AHSG或CEA單獨檢測更高，說明AHSG與CEA聯合檢測診斷膀胱癌的臨床應用價值更高。

綜上所述，AHSG在膀胱癌中的表達明顯升高，是膀胱癌診斷和預后預測的客觀評價指標，其與CEA是膀胱癌診斷和預后分析中臨床應用價值更高的、潛在的血清學標志物。