TIGIT及其配體CD155在“怒”應激大鼠胸腺細胞中的表達及其意義*

盧黃欣，陳俊賢，李瑋婷，歐陽彥楚，楊軍平△

1.江西中醫藥大學研究生院，江西南昌 330004；2.江西中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江西南昌 330006

T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(TIGIT)是一種具有免疫球蛋白結構的新型共抑制信號分子[1]，作為免疫調控受體，也是T細胞活化、凋亡以及效應功能發揮過程中重要的信號分子，其不僅對細胞的免疫激活、成熟、分化有直接調控作用，還與細胞凋亡機制有密切聯系[2]。TIGIT可以與多種配體相結合發揮作用，如CD155、CD122、CD113，其中TIGIT與CD155的親和程度最高[3]。TIGIT作為T細胞表面的負性共抑制受體，其細胞內的ITIM基序旁邊還存在一個類似免疫球蛋白尾絡氨酸(ITT)的磷酸化基序，在TIGIT與CD155信號結合后，ITT樣基序在其基點Tyr225處磷酸化并與靶淋巴細胞中的適配器Grb2結合，從而傳遞抑制性信號進而誘導T細胞凋亡，降低機體免疫調控功能[4]。

研究表明，在應激反應中，機體可通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的正常運轉，造成激素分泌異常[5]；通過神經-內分泌-免疫調節(NEI)網絡的過度調控造成免疫損傷，導致胸腺出現萎縮，胸腺細胞出現衰竭[6]；相關研究表明，特異性活躍表達于各種T細胞亞群和自然殺傷(NK)細胞中的TIGIT可通過影響T細胞自身活化通路或結合多種合作細胞干擾免疫因子的分泌，造成直接或間接的免疫功能抑制，并誘導免疫細胞衰竭[7]，同時TIGIT可與CD155結合，傳遞抑制性信號，誘導T細胞凋亡，降低機體免疫調控功能。本研究通過分析不同時程應激“怒”模型大鼠中促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)及相關免疫因子白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-10(IL-10)表達水平，探討“怒”情志對免疫功能的影響，分析不同時程應激“怒”模型大鼠胸腺中TIGIT及其配體CD155的蛋白表達水平和胸腺T細胞凋亡率，以及TIGIT分子在應激反應中與胸腺T細胞凋亡及外周免疫功能紊亂的相關性。現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 雄性SPF級Wistar大鼠48只，雄性SPF級SD大鼠12只，均為8周齡，體質量為180～200 g；2種品系的大鼠均由濟南鵬悅實驗動物繁育有限公司提供。動物合格證號：SCXK(魯)2019-0003，飼養于江西中醫藥大學生命科學院基礎實驗室動物實驗中心。購置后，隨機分籠適應性飼養7 d，飲食不限，環境濕度35%～45%，溫度(20±4)℃，采用自動明暗系統(7:00照明，19:00熄燈)；7 d后，Wistar大鼠隨機分為4組，對照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組，每組12只，對照組每6只1籠，模型各組分別單籠(50 cm×30 cm×20 cm)獨立飼養。SD大鼠作為入侵鼠，每6只1籠，實驗結束后放棄不用。對照組Wistar大鼠與SD大鼠放置于同一飼養房間，模型組Wister大鼠放置于另外一個飼養房間。實驗已經通過江西中醫藥大學動物實驗倫理委員會審查，審查批號:JZLLSC2019-0153。

1.2儀器與試劑 PowerPacTM通用Bio-Rad電泳儀購自上海一恒科技有限公司。TIGIT多克隆抗體(批號PAN056Ra)、CD155抗體(批號PAB550Ra01)均購自美國Cloud-Clone Corp.公司；內參β-actin抗體(批號mAbcam8266)購自美國mAbcam公司；一步法Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒(綠色FITC標記熒光檢測法，通用型)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；CRH、ACTH、IL-2、IL-10酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號G1120)購自北京索萊寶公司。

1.3方法

1.3.1大鼠應激“怒”模型制備 參照文獻[8-9]方法,采用“社會隔離法”結合足底電擊法對獨立飼養的Wistar大鼠復制精神應激“怒”模型。社會隔離法：制造晝夜顛倒的生存環境，每晚19:00開燈，上午7:00熄燈，飲食不限，持續14 d(對照組大鼠與入侵鼠在正常光照節律房間飼養)；從第15天開始，每天13:30-15:30進行入侵鼠干擾(隨機選取1只入侵鼠放入獨立飼養籠中接觸模型大鼠，持續15 min)；從第15天開始，每天16:00-17:30進行不可避免的足底電擊(電擊棒4 000 V，<0.5 mA，脈沖15 s，持續15 min)。模型大鼠結合性刺激分別持續7、14、21 d，完成應激“怒”模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠制備，對照組大鼠不進行任何刺激。

1.3.2取材及稱質量 記錄4組大鼠實驗前1 d及實驗后體質量，實驗完成后采取頸椎脫臼法處死大鼠，取出胸腺，以生理鹽水浸洗2次、定性濾紙吸干液體并稱質量記錄，計算胸腺指數，胸腺指數=胸腺凈質量/體質量(mg/g)。

1.3.3HE染色 胸腺標本用4%多聚甲醛固定，進行包埋、脫水、透明和浸蠟，將蠟塊固定于切片機，切下2～4 μm厚度的胸腺組織于 40 ℃水中，60 ℃烘烤2 h。經脫蠟、染色、透明和封片，于高清顯微鏡下拍照。

1.3.4胸腺細胞TIGIT、CD155蛋白表達水平測量(免疫印跡法) 提取各組大鼠胸腺組織蛋白，經過灌膠、上樣、轉模、封閉、洗膜等工作后，分別浸入TIGIT、CD155、內參一抗中孵育過夜，洗膜，孵育二抗完成后進行顯影，用軟件Alphaview SA分析蛋白條帶的相對灰度值。

1.3.5Tunel法檢測胸腺細胞凋亡率 按照1.3.3步驟將胸腺組織切片后進行脫蠟，透明，然后放入盛有pH值6.0的枸櫞酸鹽緩沖液的燒杯中，92 ℃加熱30 min，進行磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，用免疫組化筆外圈標記，按照Tunel(FITC)Kit試劑盒說明書進行熒光染色，隨機選取染色完成后的分組標本的切片，隨機視野下拍照，以Image-Pro Plus6.0圖像分析系統進行吸光度分析，并計算平均吸光度，分析胸腺T細胞凋亡率。

1.3.6血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平測量 采用真空無菌采血管取2 mL血液，以3 000 r/min離心15 min，用移液槍抽吸“透亮”上清液，轉移至EP管待測。后續操作過程嚴格遵從ELISA試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.14組大鼠實驗前后體質量及實驗后胸腺指數比較 實驗前1 d，4組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05)，實驗后4組大鼠體質量均較實驗前1 d升高(P<0.05)，但“怒”模型各組大鼠體質量均低于對照組(P<0.05)；實驗后“怒”模型各組大鼠胸腺指數均低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠實驗前后體質量及實驗后胸腺指數比較

2.24組大鼠胸腺組織形態學觀察 光學顯微鏡下(×400)觀察可見：對照組大鼠胸腺皮質部飽滿，幼稚T細胞布排整齊、細胞間隙疏松，結構分明，其細胞核染色較深，呈深藍紫色，出現少量巨噬細胞呈淡紅色(圖1A)。“怒”模型各組大鼠胸腺皮質組織結構出現不同程度的損壞，幼稚T細胞布排紊亂無序或呈“條索狀”堆積，細胞間隙縮小，細胞數量較對照組降低，細胞核染色變淺，呈淡紫色，并出現不同程度的核固縮、核分裂、細胞溶解等凋亡細胞增多現象，其中以模型7 d組、模型14 d組較為明顯(圖1B、C、D)。

注：A、B、C、D分別為對照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠胸腺組織HE染色(×400)，標尺為200px。圖1 實驗后4組大鼠胸腺組織HE染色結果

2.34組大鼠胸腺細胞TIGIT、CD155蛋白表達水平比較 4組大鼠胸腺細胞TIGIT蛋白表達水平比較，模型7 d組、模型14 d組高于對照組，模型7 d組高于模型14 d組、模型21 d組，模型14 d組高于模型 21 d組，差異均有統計學意義(P<0.05)；“怒”模型各組大鼠胸腺細胞CD155蛋白表達水平比較，模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組均高于對照組(P<0.05)。見圖2、3。

注：A、B、C、D分別為對照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠胸腺TIGIT和CD155蛋白表達水平。圖2 4組大鼠胸腺細胞TIGIT和CD155蛋白表達水平

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型7 d組比較，bP<0.05；與模型14 d組比較，cP<0.05。圖3 4組大鼠胸腺細胞TIGIT/β-actin和CD155/β-actin的相對灰度值比

2.44組大鼠胸腺T細胞的凋亡率比較 熒光顯微鏡下(×400)，以發射波長515～565 nm觀察，可見胸腺凋亡細胞呈綠色熒光；DAPI陰性復染，以發射波長340～380 nm觀察，可見凋亡細胞以外區域正常細胞胞核呈藍色熒光。4組大鼠胸腺組織凋亡細胞的吸光度比較，模型7 d組(19.92±4.04)、模型14 d組(13.53±1.56)、模型21 d組(7.97±1.37)高于對照組(5.01±1.35)，模型7 d組高于模型14 d組、模型21 d組，模型14 d組高于模型21 d組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.5實驗后4組大鼠血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平比較 血清CRH、ACTH水平比較，模型7 d組、模型14 d組高于對照組及模型21 d組(P<0.05)；IL-2水平比較，“怒”模型各組均低于對照組(P<0.05)，且模型7 d組、模型14 d組低于模型21 d組(P<0.05)；IL-10水平比較，“怒”模型各組均高于對照組(P<0.05)，且模型14 d組高于模型7 d組及模型21 d組(P<0.05)。見表2。

表2 實驗后4組大鼠血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平比較

2.6TIGIT、CD155表達水平與ACTH、CRH、IL-2、IL-10、胸腺指數、胸腺細胞凋亡程度的相關性分析 Pearson相關分析顯示，TIGIT的表達水平與CD155、ACTH、CRH、胸腺細胞凋亡程度呈正相關(P<0.05)，與IL-2呈負相關(P<0.05)，與IL-10、胸腺指數無相關性(P>0.05)；CD155的表達水平與TIGIT、胸腺細胞凋亡程度呈正相關(P<0.05)，與IL-2呈負相關(P<0.05)，與ACTH、CRH、IL-10、胸腺指數無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 TIGIT、CD155表達水平與ACTH、CRH、IL-2、IL-10、胸腺指數、胸腺細胞凋亡程度的相關性

指標IL-2rPIL-10rP胸腺指數rP胸腺細胞凋亡程度rPTIGIT-0.690<0.01 0.288>0.050.086>0.050.863<0.01CD155-0.570<0.05-0.317>0.050.099>0.050.562<0.05

3 討 論

隨著健康概念的更新和現代醫學模式的改變，“怒”等負性情緒在疾病發生、發展中的作用和機制已成為研究熱點。中醫學理論之七情致病論也認為情志與健康和疾病密切相關，其中“怒”情志首傷肝，肝失疏泄，則諸病叢生。研究表明，“肝主疏泄”是機體調控免疫系統功能活動的核心，與心理應激的免疫功能調控密切相關[10]。同時，長期心理應激和情緒異常容易導致機體NEI網絡被過度激活，HPA軸分泌異常，進一步誘發多系統組織細胞損傷，從而增加自身免疫系統疾病、癌癥、精神性疾病等的患病可能性[11-12]。

在情志致病模型中，“怒傷肝”類型是相對研究廣泛且較為成功的一種。本實驗參照文獻[8-9]方法，采用“足底電擊”和“社會隔離入侵”的方法制備“怒傷肝”模型大鼠。其中“社會隔離法”由國外學者DAVIS發明，該法對大鼠進行長期的單獨隔離并日夜顛倒飼養，有利于使動物進入“孤立無援”的生存狀態，由此提高大鼠對環境刺激的敏感性，加入入侵鼠干擾以及足底電擊更能充分體現軀體性、社會性、心理性三類應激源因素，在造模期間，大鼠表現為怒叫、呼吸加速、易激怒等明顯盛怒現象。

國外最新研究發現，身體應激和心理應激能夠引起TIGIT高表達，其對T細胞存在抑制性作用[13]，并發現TIGIT的表達與在T細胞衰竭中起關鍵作用的幾種抑制調節因子的上調有關[14]，同時，研究發現，TIGIT和CD155表達水平的升高與多種免疫系統疾病的發病機制、不良預后密切相關[15-16]。本實驗免疫印跡法結果顯示，各模型組大鼠胸腺的TIGIT和CD155蛋白的表達水平均有所上升，而CD155蛋白呈持續高水平表達趨勢，以應激7 d時效果最為明顯，提示了應激反應中大鼠胸腺幼稚T細胞的凋亡可能與TIGIT-CD155軸的表達活性存在正相關關系。目前應激反應中的NEI網絡存在多種機制相互協助，共同介導免疫抑制效應[17]。本實驗通過不同時程的慢性“怒”應激能有效提高大鼠血清中CRH、ACTH的分泌水平，提示“怒”應激大鼠HPA軸功能亢進并成功處于應激狀態，另外Tunel法結果顯示模型組大鼠胸腺皮質部幼稚T細胞的凋亡率明顯高于對照組，以應激7 d時效果最為明顯，而胸腺指數持續降低，說明了在應激反應中，大鼠的胸腺抑制與HPA軸興奮有直接關系。研究表明樹狀突細胞(DC)上的CD155與TIGIT相結合，使DC的分泌格局發生改變，促進抑制因子IL-10水平升高，活化因子IL-2水平下降，間接抑制T細胞的活化[18]。在本實驗中模型大鼠血清正性免疫調節因子IL-2水平明顯降低，而負性免疫調節因子IL-10水平明顯上升，符合TIGIT-CD155軸對DC的免疫負調節作用。同時，本實驗通過對TIGIT及其配體CD155進行相關性分析，結果提示TIGIT、CD155與HPA軸、IL-2密切相關，共同作用抑制免疫應答。值得注意的是，在此實驗中TIGIT、ACTH、CRH、IL-2的水平變化及胸腺細胞凋亡程度均在模型7 d組效果最為明顯，而模型14 d組次之，模型21 d組趨于正常；而各模型組CD155表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)，但各模型組間對比差異無統計學意義(P>0.05)。結果提示表達閾值及胸腺細胞凋亡情況可能與隨應激時間延長機體對應激源出現“適應性”改變或者通過機體“內環境”的穩態調整進行修復等有關[19]，其中IL-10表達水平呈現上調趨勢，以模型14 d組最為突出，其結果可能與應激狀態下細胞因子釋放時間的早晚有關；胸腺指數的持續降低可能與應激后體質量保持持續低值有關，其原因尚需更多研究說明。

綜上所述，“怒”應激可致HPA軸調節功能紊亂及免疫耐受能力下降，同時應激反應所造成的胸腺萎縮和胸腺細胞凋亡，可能是TIGIT-CD155軸以及HPA軸、IL-10、IL-2共同作用的結果。其結果需要進一步擴大研究范圍深入探討。本研究為闡述“怒”應激致使免疫功能損傷提供新角度，旨在強調避免“怒”情志發生，預防疾病發生或復發，為提高臨床療效提供新思路。