參芪益氣口服液質量標準研究*

李 萍，曾 金，歐人豪，韋祖巧，肖 萍

（廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院·柳州市生殖與遺傳研究所·廣西科技大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001）

參芪益氣口服液由黃芪、黨參、當歸、山銀花、山藥、黃精等11味藥材組方，系廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院在研制劑，主要用于婦女產(chǎn)后益氣、消炎，提高產(chǎn)婦免疫力，預防產(chǎn)后病，治療婦女產(chǎn)后氣血兩虛［1-3］。方中黃芪補中益氣、升陽固表，黨參健脾益氣、養(yǎng)血補氣，為君藥；當歸養(yǎng)血和營，助黃芪、黨參益氣生血之功，為臣藥；山藥、黃精平補肺脾腎三經(jīng)，益氣養(yǎng)陰，氣陰雙補，同為臣藥；山銀花清熱解毒、宣表透邪、芳香避穢，為佐藥；甘草益氣和中，調和諸藥，為使藥。本研究中建立了測定黃芪、當歸、山銀花中主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、綠原酸含量的高效液相色譜（HPLC）法，以及對黃芪、黨參、山銀花、當歸進行定性鑒別的薄層色譜（TLC）法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；FA1004型電子分析天平（上海天平儀器廠，精度為0.000 1 g）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；TDZ4-WS型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；DHG-9023AD型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海東麓儀器設備有限公司）；5～50μL移液器（BIO-DL公司，編號為NZ53228）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920-201606，純度為97.6%），綠原酸對照品（批號為110753-201716，純度為99.3%），阿魏酸對照品（批號為110773-201614，純度為99.0%），黨參對照藥材（批號為121057-201206），黃芪對照藥材（批號為121462-201705），當歸對照藥材（批號為120927-201617），山銀花對照藥材（批號為121595-201202），均購自中國食品藥品檢定研究院；參芪益氣口服液由廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院藥劑科制劑室提供；甲醇（色譜純，天津市四友精細化學品有限公司，批號為633379）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20200221）；氨水（批號為160115）；磷酸（分析純，批號為181210），均購于西隴科學股份有限公司；乙酸乙酯（分析純，廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心，批號為20180226）；甲醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號為20190417）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

按處方量稱取中藥材適量，加7倍量純化水，浸泡30～60 min，加熱煎煮，提取2次，第1次1.5 h，第2次1.0 h，合并提取液，過濾，濾液濃縮至100 mL，即得參芪益氣口服液提取液。共制備3批樣品（批號分別為20051301，20051302，20051303），保存于陰涼處，備用。

2.2 TLC鑒別

黃芪：取本品20 mL，轉移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇液提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用1%NaOH溶液洗滌3次，每次20 mL，棄去NaOH溶液，正丁醇液用水飽和正丁醇水洗至中性，棄去水液，正丁醇液水浴蒸干，殘渣用2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取缺黃芪的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。另取黃芪對照藥材5 g，加水飽和正丁醇液50 mL，加熱回流60 min，過濾，濾液按供試品溶液制備方法從“用1%NaOH溶液洗滌3次”開始制備，作為對照藥材溶液。照2020年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥBTLC法［4］試驗，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G板，以二氯甲烷-甲醇-水（6.0∶1.2∶0.3，V/V/V）為展開劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱3～5 min顯色。結果對照品溶液與供試品溶液色譜在薄層板相應位置上顯相同紫色斑點，且陰性對照無干擾（見圖1 A）。

黨參：取樣品20 mL，用水飽和正丁醇液50 mL萃取，取正丁醇液用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨試液；用正丁醇飽和的水溶液洗滌至中性，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺黨參的陰性對照品，同法制成陰性對照品溶液。取黨參對照藥材5.0 g，加水飽和正丁醇液50 mL，回流提取1 h，濾過，氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨試液；用正丁醇飽和的水溶液洗滌至中性，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照2020年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥBTLC法試驗［4］，吸取上述溶液各15μL，分別點于同一硅膠G板，以乙酸乙酯-乙醇-水（8.0∶1.0∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色。對照品溶液與供試品溶液色譜在薄層板相應位置上顯相同的紫紅色斑點，且陰性對照無干擾（見圖1 B）。

當歸：取樣品20 mL，用乙醚20 mL振搖提取，分取乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺當歸的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取當歸對照藥材0.5 g，加乙醚20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照2020年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB TLC法試驗［4］，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G板，以正己烷-乙酸乙酯（6∶3，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈365 nm下檢視。結果對照品溶液與供試品溶液色譜在薄層板相應位置上顯相同的藍色熒光斑點，且陰性對照無干擾（見圖1 C）。

山銀花：取樣品5 mL，水浴蒸干，加甲醇4 mL使溶解，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取缺山銀花的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取山銀花對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，搖勻，放置12 h，濾過，濾液作為對照藥材溶液。取綠原酸對照品10.8 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，即得質量濃度為1.08 mg/mL的綠原酸對照品溶液。照2020年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB TLC法試驗［4］，吸取上述溶液各3μL，分別點于同一聚酰胺薄膜，以微乳-甲酸（9∶1，V/V）為展開劑，其中微乳液為十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正己烷-水（6.75∶15.75∶2.50∶7.50，V/V/V/V）體系，展開，取出，晾干，在365 nm紫外燈下檢視。結果對照品溶液、對照藥材溶液與供試品溶液色譜在薄層板相應位置上顯相同的藍色熒光斑點，且陰性對照無干擾（見圖1 D）。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶999，V/V），梯度洗脫（0～10 min時10%A，10～60 min時10%A～18%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷260 nm（0～25 min，45～60 min），阿魏酸315nm（25～45min）；柱溫：30℃；進樣量：20μL；檢測時間：60 min。

2.3.2 溶液制備

分別取綠原酸對照品50.2 mg，阿魏酸對照品11.6mg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品22.4 mg，精密稱定，置25.0 mL容量瓶中，用流動相溶解，定容，得質量濃度分別2.008，0.464，0.896 mg/mL的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液8.765，0.732，0.357 mL，加流動相定容至25.0 mL容量瓶中，搖勻，即得質量濃度分別為綠原酸0.704 0 mg/mL，阿魏酸0.013 6 mg/mL，毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.0128 mg/mL的混合對照品溶液。精密吸取樣品1.0 mL，加流動相稀釋并定容至10.0 mL容量瓶中，振搖，離心（轉速為3 600 r/min）5 min，上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。分別制備缺黃芪、當歸、山銀花的陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣分析。對照品溶液和供試品溶液中綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜峰分離良好，陰性對照品溶液中指標成分相應保留時間均無吸收峰，表明該方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密吸取2.3.2項下混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用流動相定容至5.0 mL，得到系列質量濃度的混合對照品溶液，進樣分析，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y綠=15.586X綠+15.526（r=0.999 8），Y阿=115 379X阿-18 029（r=0.999 8），Y毛=75 598X毛+4 974.9（r=0.999 7）。結果表明，綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的進樣量分別 在70.40～704.00μg，1.36～13.60μg，1.28～12.80μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一批（批號為20051301）樣品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.86%，0.75%，1.07%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20051301）樣品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件下分別于0，2，4，6，10，24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.15%，1.08%，0.61%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批（批號為20051301）樣品，按2.3.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD分別為1.47%，1.30%，1.69%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為20051301）樣品0.5 mL，共6份，分別加入0.5 mL已知質量濃度（綠原酸為0.704 0 mg/mL，阿魏酸為0.013 6 mg/mL，毛蕊異黃酮葡萄糖苷為0.012 8 mg/mL）的混合對照品貯備液，加流動相定容至10.0 mL，振搖，離心，上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，按2.3.1項下色譜條件進樣測定。結果見表1。

表1 參芪益氣口服液中3個成分的加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of recovery test of three components in Shenqi Yiqi Oral Liquid（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按2.3.2項下方法制備供試品試液，分別按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。3批樣品含量測定結果見表2。

表2 參芪益氣口服液中3個成分的含量測定結果（μg/mL）Tab.2 Results of content determination of three components in Shenqi Yiqi Oral Liquid（μg/mL）

3 討論

3.1 TLC鑒別

對參芪益氣口服液中黃芪、黨參、當歸、山銀花分別進行了TLC鑒別，所建立的方法分離度好，無拖尾，專屬性強，重復性好。黃芪的鑒別參考了2020年版《中國藥典（一部）》所收錄的方法和相關文獻［5-6］，［7］315，最后確定了適合本制劑的黃芪TLC法，該法無需二次展開，且展開劑用量較少，節(jié)約了時間和成本。

采用藥典收錄的TLC法［7］293不能鑒別黨參，展開劑嘗試了氯仿-甲醇-水（6.5∶3.5∶1.0，V/V/V）的下層液，斑點清晰，但堆積于前沿，無法鑒別，最后調整為氯仿-甲醇-水（8.0∶1.0∶0.5，V/V/V），所得圖譜斑點比移值適中且分離度好。

山銀花的鑒別采用微乳薄層色譜（METLC）法，展開劑為微乳-甲酸（9∶1，V/V），樣品處理方法同藥典方法［7］32，所得圖譜特征斑點清晰，分離度好。METLC法是對傳統(tǒng)TLC法的提高和改進，主要用于黃酮、皂苷、生物堿等成分的鑒別［8］，微乳液點樣量更小，檢測靈敏度高，斑點清晰、圓而集中、不拖尾，且不使用刺激性強、揮發(fā)性大的有機溶劑，減少了環(huán)境污染，降低了試驗成本。當歸的鑒別參考2020年版《中國藥典（一部）》當歸項下收載的TLC法［7］139及文獻［9］。

3.2 含量測定方法

參考文獻［10-14］，色譜柱考察了Diamonsil-C18（2）柱、迪馬Platisil-ODS柱及Agilent HC-C18柱，結果發(fā)現(xiàn)Diamonsil-C18（2）柱、迪馬Platisil-ODS柱分離度差，基線高，不能達到有效分離；采用含碳量較高的Agilent HC-C18柱對樣品的分離度好，柱效高，峰形好。

流動相考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液，最終確定最佳流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液。組方含11味藥材，成分較復雜，樣品的處理方法對結果影響較大，分別采用甲醇、50%甲醇、1%鹽酸-甲醇流動相稀釋，采用乙酸乙酯、丙酮等液液萃取法及固相萃取法。結果表明，使用流動相乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶9，V/V）稀釋操作簡單，得到的目標成分含量高且雜質少。

3.3 方法評價

由于樣品中綠原酸的含量較阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷高很多，故本研究中采用波長切換法。阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷選擇最大吸收波長260 nm和316 nm，綠原酸則設定為吸收值不高的260 nm，方便獲取適宜的色譜圖并減少波長切換次數(shù)。此外，使用波長切換法測定本制劑含量可有效節(jié)約時間和成本。