高效液相色譜法同時測定海珠喘息定片中槲皮素和山柰酚含量*

周 峰，江 勛，彭婷婷

（湖南省衡陽市市場監督檢驗檢測中心，湖南 衡陽 421001）

海珠喘息定片由珍珠層粉、胡頹子葉、天花粉、蟬蛻、防風、冰片、甘草、鹽酸氯丙那林、鹽酸去氯羥嗪制成，具有平喘、祛痰、鎮靜、止咳功效，也用于治療支氣管哮喘、慢性氣管炎［1］，可改善慢性喘息性支氣管炎平穩期的咳喘癥狀［2-3］?，F有標準收載于1994年版《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第九冊）》，另有國家食品藥品監督管理局標準YBZ02382007，二者內容一致，但均無定量測定方法，文獻［4-6］僅涉及方中冰片、鹽酸氯丙那林、鹽酸去氯羥嗪等成分的定量分析。胡頹子葉為海珠喘息定片方中的主藥，是胡頹子科植物胡頹子Elaeagnus pungensThunb.的干燥葉，主治肺虛咳嗽、氣喘、咳血、吐血、癰疽、痔瘡、腫痛等癥，其提取物具有止咳、祛痰、平喘、廣譜抗菌等作用［7-11］。原質量標準收載于1977年版《中國藥典（一部）》含量控制項。參考文獻［12-17］和前期樣品分析結果，本研究中建立了測定海珠喘息定片中主藥胡頹子葉的指標性成分槲皮素和山柰酚含量的高效液相色譜法，為提升該制劑的質量標準提供依據?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-20AT型液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD-M20A型檢測器；AE240S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團公司，精度為十萬分之一）；XMTD-4000型八孔電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫療器械廠）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100081-201610，純度為99.1%）；山柰酚對照品（樂美天醫藥德斯特生物技術有限公司，批號為DST200829-056，純度為98%）；乙腈（批號為N9CA1H）、甲醇（批號為T3AG1H）均為色譜純，購自美國Honey Well公司；實驗用水為屈臣氏蒸餾水（批號為20190910C），其他試劑均為分析純；海珠喘息定片（沈陽紅藥集團股份有限公司，批號分別為190201，190501，180701；洛陽天生藥業有限責任公司，批號分別為190402，190102；江西南昌桑海制藥有限責任公司，批號為190359；廈門中藥廠有限公司，批號分別為191017，181226，191106，190601，181207，181208）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Shim-pack GIST-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：360 nm；進樣量：20μL。

2.2 溶液制備

分別取槲皮素、山柰酚對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含429.4μg槲皮素和295.7μg山柰酚的對照品貯備液；分別精密量取對照品貯備液各適量，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含槲皮素、山柰酚分別為8.588 0，5.913 3μg的混合對照品溶液。

取樣品10片，研細，取粉末1.5 g，精密稱定，至帶塞錐形瓶中，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）的混合溶液50 mL，加熱回流30 min，放冷，轉移至100 mL容量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

按海珠喘息定片處方工藝制備缺胡頹子葉的陰性對照樣品，并依法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。結果顯示，陰性對照品溶液在對照品溶液色譜峰相應位置上無吸收峰，表明樣品中其他物質不影響樣品的測定結果，方法專屬性強。在該色譜條件下，各成分可達到基線分離，分離度均大于1.5。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察、檢測限和定量限確定：取2.2項下混合對照品溶0.50，1.25，2.50，3.50，5.00，6.00，7.50，9.00，10.00 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質量濃度的標準溶液，分別進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸。以信噪比（S/N）為3∶1時的含量為檢測限，以信噪比為10∶1時的含量為定量限。結果見表1。

表1 槲皮素和山柰酚線性關系考察結果及檢測限和定量限Tab.1 Results of linear relation test，LOD and LOQ

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定5次，記錄色譜圖。結果槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別為0.64%和1.01%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為190359）樣品，研細，平行6份，并按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果樣品中槲皮素和山柰酚的含量分別為0.225 2 mg/g和0.154 5 mg/g，RSD分別為1.11%和1.96%（n=6）。

穩定性試驗：取重復性試驗項下制備的供試品溶液適量，分別于0，3，8，12，18，24 h時進樣測定。結果槲皮素和山柰酚含量的RSD分別為1.41%和1.28%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為190359）1.5 g，精密稱定，共9份，置帶塞錐形瓶中，分別精密加入槲皮素和山柰酚對照品，按2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定，并計算回收率。結果見表2。

表2 樣品中槲皮素和山柰酚加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of quercetin and kaempferol in the samples（n=9）

耐用性試驗：選取不同廠家的色譜柱（Shimadzu Shim-pack GIST-C18柱、Phenomenex Kinetex C18柱、Agela Venusi MPC18柱）及不同廠家和型號的高效液相色譜儀（Shimadzu LC-20AT型、Waters 2695型）測定供試品溶液，結果不同廠家色譜柱和不同型號儀器均能較好地分離樣品，耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取樣品1.5 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別平行測定2次，并計算槲皮素和山柰酚的含量。結果見表3。

表3 樣品中槲皮素和山柰酚含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of content determination of quercetin and kaempferol in the samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 指標性成分選擇

目前，從胡頹子葉中分離出的化學成分包括黃酮類、生物堿類、揮發油類、三萜類等，其中黃酮類化合物最多。胡頹子葉中總黃酮可舒張小鼠氣管平滑肌，其舒張作用機制與阻斷L型鈣通道電流有關［11］。因此，可以推斷海珠喘息定片中黃酮類化合物為其功效成分。但難以直接測定胡頹子葉中各種黃酮苷的含量，黃酮苷經水解發現，其苷元主要為山柰酚、槲皮素和異鼠李素［9，18］，故選擇測定水解后產生的槲皮素與山柰酚代表成分的含量。

3.2 提取溶液體積選擇

考察了甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）混合溶液不同體積（30，40，50，60，70 mL），加入提取溶劑50 mL后，再增加體積，樣品溶液中提取的槲皮素和山柰酚的量無顯著差異，故選擇50 mL甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）作為提取溶液。

3.3 色譜條件選擇

比較了不同系統和比例的流動相，如乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫、甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫、甲醇-0.4%磷酸水溶液（52∶48，V/V）等度洗脫等［13，15，19］，考慮到梯度洗脫較復雜，且分析時間過長，選擇甲醇-0.4%磷酸水溶液（52∶48，V/V）等度洗脫為初始色譜條件，但試驗過程中發現山柰酚與后面的峰分離效果不佳，經反復摸索，調整為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）。結果槲皮素、山柰酚與相鄰峰分離度均良好，且供試品溶液的分析時間控制也較合理。

3.4 樣品含量測定結果分析

由表3可知，不同生產廠家樣品間槲皮素和山柰酚的含量差異較大，同一生產廠家、不同批號間的差異較小，可能與不同生產廠家間胡頹子葉藥材的質量差異及生產工藝有關?，F有研究表明，不同產地胡頹子葉中槲皮素和山柰酚的含量存在差異［16］。

3.5 方法評價

本研究中建立的高效液相色譜法操作簡便，結果準確，專屬性強，重復性和穩定性均良好，可用于海珠喘息定片的質量控制。