柱前衍生高效液相色譜法測定注射用骨肽中15種氨基酸含量

張雪艷，郭 雷，周長明，張建敏

（北京市藥品檢驗所·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

注射用骨肽是以新鮮或冷凍豬四肢提取的骨肽溶液制成的無菌凍干品，含有多種多肽類骨代謝活性因子、有機鈣、磷、無機鹽、氨基酸、微量元素等，是一種具有生物活性的多組分生化藥，可促進骨折愈合，修復損傷，減輕疼痛，也可改善增生性骨關節(jié)疾病及風濕、類風濕關節(jié)炎等癥狀［1-4］。2020年版《中國藥典》未收載骨肽類制劑。國家藥品標準YBH16462005中，采用雙縮脲法測定注射用骨肽中多肽的含量，通過磺基水楊酸與蛋白質產生沉淀，規(guī)定了蛋白質的限度，但未規(guī)定氨基酸的含量［5-6］。目前，氨基酸的檢測方法很多，如氨基酸自動分析儀、氣質聯(lián)用儀和柱前衍生高效液相色譜（HPLC）法［7］。柱前衍生化法屬間接分析法，樣品中氨基酸在特定條件下與衍生試劑發(fā)生化學反應，生成有發(fā)色或發(fā)光的衍生物后，再進行色譜分離和測定，廣泛用于動物藥中氨基酸類成分的測定［8-12］。常用衍生試劑有鄰苯二甲醛（OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）、2，4-二-硝基氟苯（DNFB）、異硫氰酸苯酯（PITC）等，本研究中建立了測定注射用骨肽中門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸15種氨基酸含量的鄰苯二甲醛柱前衍生HPLC法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Seven Easy型酸度計，XS205型電子天平（精度為十萬分之一），均購于瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 試藥

標準氨基酸對照溶液（美國Waters公司，批號為VC290480，規(guī)格為2.5μmol/mL）；精氨酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為140624-201506，規(guī)格為每支100 mg，純度為99.9%）；硼酸鈉，二水合磷酸二氫鈉，甘露醇，均購于國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛（Sigma-Aldrich公司）；乙腈、甲醇（色譜純，默克股份兩合公司）；水為超純水；注射用骨肽（批號分別為1901161E1，1904211E1，171109E2，規(guī)格為每支含25 mg多肽）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse AAA柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A為40 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=7.8），B為乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V/V）溶液，梯度洗脫程序見表1；流速：2.0 mL/min；檢測波長：338 nm；柱溫：40℃。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

自動衍生化進樣程序：吸取0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液2.5μL、待測溶液0.5μL，在100μL自動進樣器中混合2次，等待0.5 min；吸取鄰苯二甲醛衍生溶液0.5μL，在100μL自動進樣器中混合6次；吸取水32μL，在100μL自動進樣器中混合2次，進樣。

2.2 溶液制備

取鄰苯二甲醛80 mg，精密稱定，加入0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 10.2）7 mL、乙腈1 mL、巰基丙酸125μL，混勻，即得鄰苯二甲醛衍生溶液，于4℃保存。取硼酸鈉15.25 g，加水100 mL溶解，用氫氧化鈉溶液調pH至10.2，即得硼酸鹽緩沖液。取標準氨基酸對照溶液（質量濃度為2.5μmol/mL）作為對照品貯備液，精密量取4 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，即得對照品溶液。取樣品1支，精密加水5 mL，溶解，搖勻，即得供試品溶液。取甘露醇（注射用骨肽中輔料）100 mg，精密稱定，加5 mL水溶解，即得空白溶劑。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果空白溶劑未出現(xiàn)干擾主峰測定的色譜峰，供試品溶液與對照品溶液色譜中，氨基酸峰保留時間一致，各氨基酸間分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察、檢測限和定量限確定：取對照品貯備液40，80，200，400，600μL，分別加水稀釋至1 mL，制成氨基酸質量濃度分別為0.10，0.25，0.50，1.00，1.25μmol/mL的系列溶液，取上述溶液和對照品貯備液各適量，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以質量濃度（X，μmol/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，分別計算14種氨基酸（除精氨酸）的回歸方程。取精氨酸49.80 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加水溶解并定容，作為精氨酸對照品貯備液，精密量取0.2，1.6，3.2，4.8，6.4，8.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得精氨酸線性溶液。結果見表1。以信噪比（S/N）為3∶1時的質量濃度為檢測限，S/N為10∶1時的質量濃度為定量限。結果檢測限和定量限分別為0.008 3 nmol/μL和0.025 0 nmol/μL。

重復性試驗：取樣品1支，精密加入5 mL水，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果峰面積的RSD為0.25%～1.64%，表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算15種氨基酸的含量。結果的RSD為0.37%～1.64%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為1901161E1）3支，精密加入5 mL水溶解，搖勻，作為本底溶液。精密量取本底溶液0.5 mL，分別加入氨基酸對照品溶液0.25，0.50，0.75 mL，水0.75，0.50，0.25 mL，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，記錄色譜圖。按外標法計算樣品中15種氨基酸的回收率，結果見表2。

表2 15種氨基酸線性關系考察與加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the linear relation test and the recovery test of 15 amino acids（n=9）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按2.1項下色譜條件測定樣品中15種氨基酸的含量。結果見表3。

表3 3批注射用骨肽中15種氨基酸的含量測定結果（%）Tab.3 Results of content determination of 15 amino acids in three batches of Ossotide for Injection（%）

3 討論

注射用骨肽是結構復雜、多組分的生化藥，其回收試驗與組分單一、純度高的化學藥相比，要求規(guī)范操作，精確取樣，以減少誤差。注射用骨肽中15種氨基酸的加樣回收試驗按1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5設計，結果回收良好。另外，樣品中精氨酸質量濃度為0.72 mg/mL，遠高于其他氨基酸的質量濃度，單獨制備精氨酸的線性溶液，考察精氨酸質量濃度與峰面積的線性關系，結果較好。

注射用骨肽是從動物組織中提取的藥物，成分的含量會影響藥效及不良反應，質量可控性不夠一直制約著骨肽類藥物的應用和發(fā)展。注射用骨肽質量標準中并未規(guī)定氨基酸檢查項，若控制每種氨基酸的含量，會增加企業(yè)生產成本，但通過測定注射用骨肽中氨基酸總含量，可為生產企業(yè)控制注射用骨肽的質量、監(jiān)控生產工藝提供參考，也可供類似品種的質量控制參考。

本研究中建立的方法操作簡便，靈敏度高，結果準確，重復性和穩(wěn)定性均較好，可實現(xiàn)在線衍生，減少人員誤差，可用于測定注射用骨肽中15種氨基酸的含量。