回春育子顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

曹寶帥，薛剛強(qiáng)，頡維民，潘新艷

（1.河北省衡水市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 衡水 050024；2.河北省石家莊市第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011；3.河北省人民醫(yī)院績(jī)效考核辦公室·質(zhì)量管理控制辦公室，河北 石家莊 050051）

回春育子顆粒為石家莊市第四醫(yī)院的院內(nèi)制劑，是由炙淫羊藿、枸杞子、熟地黃、當(dāng)歸、甘草、骨碎補(bǔ)、川續(xù)斷等20余味中藥材制成的中藥復(fù)方顆粒，臨床用于治療腎精虧虛之精子活動(dòng)力差、死精過多、精子數(shù)少等原因造成的不育癥［1］。基于中醫(yī)腎精虧虛型不育癥的辨證機(jī)理和西醫(yī)少弱精子癥發(fā)病機(jī)制的研究基礎(chǔ)，前期研究中對(duì)回春育子顆粒的組方和臨床療效進(jìn)行研究，確定了具有代表性的中藥成分和化合物作為質(zhì)量標(biāo)志物［2-6］。方中淫羊藿溫補(bǔ)腎陽(yáng)，熟地黃、五味子滋補(bǔ)腎陰，甘草祛濕熱、清邪毒，川續(xù)斷補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，當(dāng)歸補(bǔ)肝腎、益精血。甘草具有保護(hù)睪丸和抗生殖系統(tǒng)炎癥等作用［7-8］；續(xù)斷、燙狗脊、骨碎補(bǔ)藥理活性成分具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗菌、抗氧化等作用［9-11］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，回春育子顆粒組方中淫羊藿、五味子的藥理活性成分能促進(jìn)體內(nèi)相關(guān)遞質(zhì)和激素的釋放，改善勃起功能，提高性欲，改善生精細(xì)胞功能，促進(jìn)精子生成等［12-15］。目前，回春育子顆粒的質(zhì)量控制僅采用薄層色譜（TLC）法對(duì)炙淫羊藿苷和枸杞子對(duì)照藥材進(jìn)行定性鑒別。但本制劑由多味中藥材組方，多靶點(diǎn)作用于不育癥，僅做定性鑒別具有一定局限性［2］。因此，本研究中對(duì)回春育子顆粒組方所確定的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行定性鑒別和定量分析，為提高回春育子顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬(wàn)分之一）；KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為45/80/100 kHz）；全自動(dòng)薄層色譜成像系統(tǒng)（上海科哲生化科技有限公司）；硅膠G薄層板，硅膠GF254薄層板，均購(gòu)于青島海洋化工有限公司。

1.2 試藥

回春育子顆粒（醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為20180320，20180522，20180807）；當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)為120927-201617），熟地黃對(duì)照藥材（批號(hào)為121196-201406），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為120904-201620），川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品（批號(hào)為111685-201707，純度為90.9%），原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)為110809-201205，純度為99.9%），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110773-201614，純度為99.0%），柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110722-201613，純度為94.3%），淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)為110737-201516，純度為94.2%），五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)為110857-201714，純度為99.9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；水為屈臣氏桶裝水，其他試劑均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

當(dāng)歸：取樣品（批號(hào)為20180522）粉末10 g，加乙醇10 mL，回流10 min，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取當(dāng)歸對(duì)照藥材1 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。按處方和工藝制備缺當(dāng)歸的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照藥材溶液5μL、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1，V/V）為展開劑，展開，在紫外光（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

熟地黃：取樣品（批號(hào)為20180522）粉末15 g，加乙酸乙酯30 mL，振搖提取2次，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取熟地黃對(duì)照藥材4 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。按處方和工藝制備缺熟地黃的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照藥材溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開劑，展開，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液顯色，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 B。

川續(xù)斷：取樣品（批號(hào)為20180522）粉末20 g，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解；水溶液加石油醚（30～60℃）40 mL，振搖提取，棄去石油醚液，水層加水飽和的正丁醇30 mL，振搖提取3次，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。用甲醇制備每1 mL含5 mg的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液。按處方和工藝制備缺續(xù)斷的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）10℃以下放置的下層溶液為展開劑展開，噴以5%磷鉬酸乙醇試液顯色，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 C。

甘草：取川續(xù)斷鑒定項(xiàng)下的供試品溶液適量；取甘草對(duì)照藥材1 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾液濃縮至2 mL，作為對(duì)照藥材溶液；按處方和工藝制備缺甘草的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照藥材溶液、樣品溶液和陰性對(duì)照品溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶1∶2，V/V/V）為展開劑，展開，在紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 D。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm（原兒茶酸），320 nm（阿魏酸），283 nm（柚皮苷），270 nm（淫羊藿苷），250 nm（五味子醇甲）；進(jìn)樣量：10μL。分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白輔料溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果5個(gè)目標(biāo)峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，且理論板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the system suitability test

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of mobile phase（%）

2.2.2 溶液制備

取對(duì)照品原兒茶酸11.13 mg、阿魏酸9.77 mg、柚皮苷10.50 mg、淫羊藿苷10.81 mg、五味子醇甲10.05 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成對(duì)照品貯備液。分別精密量取原兒茶酸、阿魏酸及五味子醇甲對(duì)照品貯備液各1 mL，柚皮苷對(duì)照品貯備液0.15 mL，淫羊藿苷對(duì)照品貯備液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品5 g，精密稱定，置錐形瓶中，稱定質(zhì)量，精密加入甲醇25 mL，加熱回流60 min，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，即得供試品溶液。按處方比例稱取空白輔料適量，按供試品溶液制備方法制備空白輔料溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察、定量限和檢測(cè)限確定：分別精密量取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表2。分別以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察、定量限和檢測(cè)限確定結(jié)果Tab.2 Results of linear relation test，LOD and LOQ

精密度試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液500μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算峰面積。結(jié)果原兒茶酸、綠原酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲峰面積的RSD分別為0.23%，0.11%，0.86%，1.54%，0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20180522）適量，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積。結(jié)果原兒茶酸、綠原酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲峰面積的RSD分別為1.01%，0.96%，1.15%，0.61%，1.52%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20180522）適量，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算含量。結(jié)果原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的平均含量分別為41.74，16.04，3.68，80.06，33.05μg/g，RSD分別為1.56%，1.67%，1.02%，1.32%，1.99%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取2.2.2項(xiàng)下原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲對(duì)照品貯備液1 000，400，100，2 000，800μL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。取已知含量的樣品（批號(hào)為20180522，規(guī)格為每袋15 g）2.5 g，研細(xì)，精密稱定，依法制備供試品溶液，加入2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法分別計(jì)算原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of five components in the samples（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 提取方法選擇

曾采用乙醇加熱回流代替乙醚超聲提取當(dāng)歸。石油醚代替乙醚提取川續(xù)斷皂苷Ⅵ，避免了易制毒化學(xué)試劑的使用。曾分別以甲醇、30%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液和80%甲醇水溶液考察提取溶劑，且考察了不同超聲時(shí)間（20，30，45，60 min）對(duì)目標(biāo)化合物提取的影響。結(jié)果以甲醇為提取溶劑進(jìn)行加熱回流時(shí)目標(biāo)化合物響應(yīng)較好，提取效率較高。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

曾采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描稀釋劑超聲溶解的對(duì)照品，結(jié)果原兒茶酸、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷及五味子醇甲分別于260，316，280，270，250 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

3.3 流動(dòng)相選擇

曾采用乙腈-水溶液［3］、甲醇-水溶液［4］、0.01 mol/L己烷磺酸鈉-乙腈-甲醇-冰醋酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.0）［8］、0.2%己烷磺酸鈉（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.5）-甲醇-乙腈溶液［9］、緩沖液（0.11%己烷磺酸鈉、0.02%庚烷磺酸鈉混合溶液，每1 000 mL加0.2 mL三乙胺，用5%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.5）-乙腈-甲醇溶液（70∶10∶20，V/V/V）［10］、0.01mol/L庚烷磺酸鈉-乙腈-三乙胺溶液［11］、甲醇-0.1%磷酸水溶液等作為流動(dòng)相對(duì)多組分進(jìn)行洗脫，結(jié)果峰寬過大、前延拖尾、分叉峰及分離度過小，干擾目標(biāo)峰檢測(cè)。最終選擇以甲醇-0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，處方中其他物質(zhì)對(duì)5種待測(cè)組分無(wú)干擾，均能檢出，相較參考文獻(xiàn)中其他方法的色譜峰峰形良好，分離良好，操作簡(jiǎn)便。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，可用于回春育子顆粒的質(zhì)量控制。