超高效液相色譜-串聯質譜法檢測抗癲癇類中成藥及保健食品中15種非法添加化學藥物*

王超眾，南俊伶，王萌萌，3，劉信奎，劉春峰，于百青，初紅濤

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省齊齊哈爾市藥品檢驗中心，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；4.齊齊哈爾大學，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

癲癇是由多種原因導致的腦部神經元高度同步化異常放電的臨床綜合征，俗稱羊癲瘋或羊角風，其臨床表現具有發作性、短暫性、重復性和刻板性的特點［1-4］?？拱d癇藥物的臨床風險極大，屬精神類藥品，副作用大，治療窗窄，是一類需要嚴格管控的化學藥物［5-9］，極易發生不良反應和中毒事件，使用時必須監測血藥濃度并及時調整用藥［10-11］。近年來，有非法商家向所謂“純中藥”“保健食品”中非法添加抗癲癇類化學藥物現象，由于在處方中未標明含有化學藥物成分，造成患者大量長期服用，存在較大安全隱患，有必要建立檢測抗癲癇類化學藥物的方法。目前通過檢測患者抗癲癇藥物的血藥濃度間接檢測［12-13］，或采用酶聯免疫法［14］和高效液相色譜法［15］直接檢測，但專屬性均不強，靈敏度不高，檢驗結果不準確。超高效液相色譜-串聯質譜（UHPLC-MS/MS）法［16］是檢驗非法添加藥物的主流方法，但本研究中涉及的非法添加藥物僅2種，覆蓋面太小。根據原國家食品藥品監督管理局批復的藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（編號分別為2009024，2012004，2013002）可檢測21種非法添加藥物，覆蓋的藥物較全面，但檢測方法用時較長、專屬性和靈敏度均較差。為此，本研究中以臨床較常用的15種抗癲癇藥物為分析目標，建立了測定此類非法添加化學藥物的UHPLC-MS/MS法?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Vanquish H型高效液相色譜儀（配有Xcalibur 3.0.63工作站），Thermo TSQ Quantum Access型質譜儀（配有Chromeleon 7.2.10工作站），均購自美國Thermo公司；Sartorius BP211D型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）；Rotina 380R型高速冷凍離心機（美國Hettich公司）；KQ-500VDV型臺式三頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為45 kHz）。

1.2 試藥

三唑侖對照品（批號為171230-201804，含量為99.9%），咪達唑侖對照品（批號為171265-201402，含量為99.8%），勞拉西泮對照品（批號為171253-201803，含量為99.9%），氯硝西泮對照品（批號為171227-201404，含量為99.7%），阿普唑侖對照品（批號為171218-201305，含量為99.5%），扎來普隆對照品（批號為100670-201602，含量為99.8%），氯氮卓對照品（批號為171248-201403，含量為99.8%），艾司唑侖對照品（批號為171219-201604，含量為99.9%），奧沙西泮對照品（批號為171229-201505，含量為99.8%），地西泮對照品（批號為171225-201304，含量為99.9%），硝西泮對照品（批號為171217-201403，含量為99.9%），苯巴比妥對照品（批號為171222-201206，含量為99.7%），異戊巴比妥對照品（批號為171221-201203，含量為99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；司可巴比妥對照品（USPharmacopeial Convention，批號為USP-1611004，含量為95.6%）；巴比妥對照品（國家麻醉品實驗室，批號為1220-9201，含量為99.0%）；實測樣品來自市場抽檢；乙腈、甲酸、乙酸銨（色譜純，美國Fisher試劑公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ACESC18柱（150 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：A為10 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸，B為乙腈，梯度洗脫（0～2.0 min時90%A，2.0～4.0 min時65%A，4.0～6.5 min時60%A，6.5～9.0 min時20%A，9.0～12.0 min時10%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：2μL。

2.1.2 質譜條件

電離方式：電噴霧電離正負離子模式（ESI+，ESI-）；檢測方式：選擇反應監測（SRM）；霧化氣：氮氣；鞘氣流速：30 bar；輔助氣流速：10 bar；源電壓：4 000 V（+），3 500 V（-）；毛細管溫度：270℃；定性離子對、定量離子對、碰撞能量和離子化模式見表1。

2.2 溶液制備與測定

分別取三唑侖、咪達唑侖、勞拉西泮、氯硝西泮、阿普唑侖、扎來普隆、氯氮卓、艾司唑侖、奧沙西泮、地西泮、硝西泮、司可巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥、巴比妥對照品適量，精密稱定，用甲醇超聲處理，制成質量濃度為100μg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述溶液，用初始流動相稀釋成含上述物質質量濃度均為5 00 ng/mL的混合對照品溶液。按2.1項下色譜-質譜條件進樣分析，記錄SRM色譜圖，見圖1。

圖1 混合對照品溶液的SRM色譜圖Fig.1 SRM chromatograms of mixed reference solution

供試品溶液：取樣品1 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提取15 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，5 000 r/min離心5 min，上清液經0.22μm微孔濾膜過濾；若樣品中含有油脂，將樣品提取液置-20℃條件下放置24～48 h，放置時間可視樣品是否澄清而定；再離心處理，過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取混合對照品貯備液適量，用初始流動相稀釋成質量濃度分別為50，100，200，500，1 000，1 500，2 000 ng/mL的系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜-質譜條件進樣分析，記錄SRM色譜圖，以質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表2。表明各化合物質量濃度在50～2 000 ng/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：吸取線性關系考察項下最低質量濃度溶液，用初始流動相稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄SRM色譜圖，分別以信噪比為3∶1和10∶1時的含量為檢測限和定量限。結果見表2，表明方法的靈敏度完全能滿足非法添加化學藥物的檢測要求。

表2 15種化合物含量測定方法學考察結果Tab.2 Methodological investigation of content determination of 15 compounds

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜-質譜條件連續進樣測定6次，記錄SRM色譜圖。結果15種化學藥物定量離子對質譜峰峰面積的RSD為0.45%～1.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取陰性樣品（已知不含15種非法添加化學藥物的樣品），加入適量混合對照品貯備液，混勻，2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜-質譜條件進樣測定6次。結果各成分含量的RSD為1.10%～3.21%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時進樣分析，記錄定量離子對SRM色譜圖。結果峰面積的RSD為1.54%～3.12%（n=7），表明供試品溶液在12 h內穩定。

加樣回收試驗：取陰性樣品1 g，精密稱定，分別置6個50 mL容量瓶中，分別精密加入混合對照品貯備液0.25 mL，按供試品溶液制備項下“加甲醇適量”起操作，取續濾液進樣測定，并計算回收率。結果見表2，表明方法準確度良好。

2.4 樣品檢測

取16批樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，以外標法計算非法添加藥物的含量。經測定，16批樣品中，1批檢出非法添加地西泮，含量為23.21 mg/g；2批檢出非法添加苯巴比妥，含量分別為15.35 mg/g，17.89 mg/g，非法添加率為18.75%。

2.5 與法定方法靈敏度比較

由表3可知，法定方法采用高效液相色譜（HPLC）法對目標化合物進行定量分析，主要靠藥物的紫外吸收來檢測，靈敏度較低；本研究中新建方法采用UHPLC-MS/MSSRM模式定量分析，用二級定量碎片離子的離子強度來檢測，提高了定量限。法定方法采用比對一級、二級全掃描圖譜的方法進行鑒別，在本底較高的情況下會影響定性的檢測限；新建方法采用SRM掃描模式進行定性鑒別，可提高檢測限。

表3 法定方法與新建方法靈敏度比較Tab.3 Comparison of sensitivity between the statutory method and the new method

3 討論

3.1 色譜條件選擇

共測定了非法添加的15種化學藥物，成分較多且某些化合物化學性質相近，故在UPLC中很難實現較好分離。曾考察乙腈-水、乙腈-乙酸、乙腈-乙酸銨、0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨-乙腈等流動相體系，因質譜檢測要采用正負離子同時掃描，因此還要考慮流動相的pH，經過考察，采用10 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）-乙腈為流動相時各化合物峰形、出峰時間等參數均較好，因此確定為最終測定條件。

3.2 質譜條件選擇

本試驗中檢測的化合物較多，某些化學性質相近的化合物很難在色譜系統中達到有效分離，只能通過優化質譜條件，發揮串聯質譜檢測器專屬性強的特點來實現對各化合物的準確檢測，因此質譜條件的確立尤為重要。本試驗中對各組分離子對及碰撞電壓進行優化，得到最佳離子響應強度，最終確定了正負離子同時掃描的質譜條件，實現了對15種化合物的同時分析。

3.3 與法定方法的比較

檢驗成本：法定方法采用高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法、薄層色譜（TLC）法、HPLC法全掃描相結合的方法鑒別，采用HPLC法定量的方式，共用到3個TLC系統、3個HPLC系統和3個HPLC-MS/MS系統，故此方法檢驗1批藥品要至少重復3次鑒別和3次定量檢驗，操作煩瑣，耗費較多的人力和物力。而本研究中新建立的方法只采用1個UHPLC-MS/MS系統即可對樣品進行定性和定量檢驗，減少了操作步驟，節省了時間和耗材，大大降低了檢驗成本，更節能環保。

專屬性：法定方法主要采用HPLC-MS/MS一級全掃描和二級全掃描模式進行定性鑒別，檢驗單一的純品尚可，但樣品輔料較多、成分較復雜、多成分分離度較差時專屬性會大打折扣，易出現假陰性或假陽性的檢驗結果。本研究中采用UHPLC-MS/MSSRM模式，以二級碎片離子的相對豐度進行定性鑒別，大大提高了檢驗的專屬性，彌補了法定方法的不足，是目前定性檢測藥物殘留的主流方法。