小建中湯治療抑郁癥作用機制的網絡藥理學研究*

賈 暖，趙佳鋒，錢萬橋，張柳燕，郭 順

（南方科技大學醫院，廣東 深圳 518055）

抑郁癥以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，是心境障礙的主要類型。嚴重困擾患者的生活，影響其正常的社會功能［1］。據世界衛生組織統計，2015年全球抑郁癥患病人數已達3.22億，中國的抑郁癥患病率約為4.2%［2］；2019年，中國精神衛生調查研究報告顯示，我國抑郁癥患者的終身患病率為6.8%，12個月患病率為3.6%［3］；2017年，世界衛生組織有關全球疾病負擔的統計顯示，抑郁障礙的傷殘損失壽命年排第三位［4］。抑郁癥不僅損害患者的健康，而且給家庭和社會造成極大負擔。目前，西醫治療抑郁癥存在許多不足，中藥及其復方制劑治療效果好，副作用少，依從性高［5］。小建中湯和舒肝解郁膠囊治療焦慮癥的有效率分別為97%和90.9%［6］。小建中湯治療老年抑郁癥2周、4周后，緩解抑郁情緒的有效例數分別為7/12例、10/12例［7］。小建中湯是《傷寒論》經方，由飴糖、桂枝、芍藥、甘草、大棗、生姜組方，為溫養中焦之劑，溫中補虛，和里緩急，主治中焦虛寒、肝脾不和證，但其治療郁證的研究相對較少［8］。2007年，英國鄧迪大學Hopkins教授在網絡生物學的基礎上提出網絡藥理學［9］，通過構建藥物-靶點-基因-疾病的相互作用網絡，運用專業的可視化網絡分析軟件及算法，對現有數據庫信息進行虛擬篩選和網絡預測，探討藥物的作用機制［10］。由于其復雜性、整體概念及中醫理論的辨證論治，中藥作用機制的研究較困難。網絡藥理學研究理念恰好與中藥多組分、多靶點、協同調節的作用模式契合，具有整體性、系統性的特點［11］。本研究中采用網絡藥理學探討了小建中湯抗抑郁的作用機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 潛在活性成分及靶點篩選

通過檢索TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/index.php）得到飴糖、桂枝、芍藥、甘草、大棗、生姜的所有化合物成分，設定口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、血腦屏障（BBB）≥-0.3為篩選條件，篩選出潛在的活性成分。再檢索PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），得到活性成分的2D結構，最后在Swiss TargetPrediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch）預測靶點，同時運用Cytoscape 3.8.0軟件構建主要潛在活性成分-靶點網絡。

1.2 抑郁癥靶點獲取

通過檢索GeneCard數據庫（https://www.genecards.org/）、OMIM數據庫（http://www.omim.org/）、DisGeNET數據庫（http://www.disgenet.org），得到與抑郁癥相關的所有靶點基因，通過Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/），校對得到靶點基因名，選擇生物物種為homo sapiens（human）。選擇3個數據庫中2個數據庫及以上共有的靶點作為疾病候選靶點。

1.3 蛋白互作網絡（PPI）構建

將藥物的靶點蛋白和疾病候選靶點蛋白分別導入String數據庫（https://string-db.org/），物種設為“Homo sapiens”，閾值設為中等置信度“mediumconfidence=0.4”，其余參數保持默認設置不變，獲取2個蛋白相互作用的PPI。結果以.tsv格式保存，并導入Cytoscape 3.8.0軟件，通過“Merge”功能得到2個PPI的交集網絡，再利用“Network Analysis”功能分析網絡的拓撲屬性，依據其節點度值的網絡拓撲參數，明確核心靶點蛋白。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

使用Metascape在線分析工具（http://metascape.org）對網絡合并后獲得的核心靶點蛋白分別進行GO富集分析和KEGG通路分析。采用統計學超幾何分布定量（P）＜0.01評估存在于各GO注釋中的蛋白質群，以P值反映蛋白質生物學功能的顯著性，選擇生物過程、分子功能、細胞組分3個模塊。通過KEGG通路分析的功能條目，考察中藥的潛在靶標可能具有的生物學功能及參與的生物學通路，進而得到小建中湯治療抑郁癥的主要作用通路。

2 結果

2.1 小建中湯潛在活性成分及靶點獲取

共得到90個潛在活性成分，桂枝3個，甘草69個，大棗18個，白芍3個，生姜5個，其中有4個成分是2個以上藥物的共有成分。TCMSP數據庫無法檢索到飴糖，由于飴糖在小建中湯中含量較高，結合TCMID數據庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）和文獻［12-13］，保留其麥芽糖這一主要活性成分。去掉Swiss TargetPrediction數據庫預測到的靶點可能性小于0.1及無法預測到靶點的成分，增加肉桂醛、芍藥苷、牡丹酚、沒食子酸4個可能對抑郁癥有作用的成分［14-16］。最終得到68個成分，其中潛在活性成分桂枝4個，甘草51個，大棗9個，白芍6個，生姜5個，飴糖1個。在Swiss TargetPrediction數據庫中檢索潛在活性成分，獲得144個靶點，同時運用Cytoscape 3.8.0軟件構建藥物-潛在活性成分-靶點網絡，得到6個藥物，68個藥物成分，144個靶點基因。節點的度值越大，節點大小越大，顏色越深。詳見圖1。

圖1 藥物-藥物成分-靶點基因網絡Fig.1 Herbs-active ingredient-target gene network

2.2 抑郁癥靶點獲取、PPI構建及核心網絡提取

通過檢索GeneCard，OMIM，DisGeNET 3個數據庫，并經Uniprot數據庫校對，得到2個及以上數據庫共有的疾病靶點，共1 844個疾病基因。藥物靶點基因與疾病靶點基因分別做PPI后，去掉游離節點，得到藥物靶點基因的PPI共132個節點，909條邊；疾病靶點基因的PPI共1 735個節點，45 251條邊。2個網絡交集得到67個節點、434條邊的PPI網絡，通過設置度值＞12（度值的中位數），篩選得36個節點、280條邊的PPI，得到核心靶點基因36個。詳見圖2。其對應的核心活性成分36個（見表1）。根據度值測算出小建中湯治療抑郁癥的前10個重要靶標，分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、單胺氧化酶A（MAO-A）、單胺氧化酶B（MAO-B）、海馬神經元中淀粉樣前體蛋白（APP）、乙酰膽堿酯酶（AChE），以 及CNR1，CHRNA4，SLC6A4，DRD2，SLC6A3。

表1 小建中湯治療抑郁癥的核心活性成分Tab.1 Core active ingredients of Xiaojianzhong Decoction in the treatment of depression

圖2 核心靶點基因網絡提取過程Fig.2 Extraction process of core target gene network

2.3 核心靶點基因GO富集分析及KEGG通路分析

使用Metascape在線分析工具對小建中湯治療抑郁癥的36個核心候選靶點進行GO富集分析，生物過程共富集到630條，主要涉及化學突觸傳遞、G蛋白耦聯受體信號通路、與環狀核苷酸第二信使耦聯、神經遞質水平的調節、化學突觸傳遞的調節等，詳見圖3。分子功能共富集到61條，主要涉及G蛋白耦聯的胺受體活性、神經遞質受體活性、兒茶酚胺結合、腎上腺素受體活性、多巴胺結合、血清素受體活性等，詳見圖4。細胞組分共富集到46條，主要涉及突觸前膜、突觸后膜、樹突、膜筏等，詳見圖5。使用Metascape在線分析工具對小建中湯治療抑郁癥的36個核心候選靶點進行KEGG生物途徑富集分析，共富集到31條。結果顯示，其機制主要涉及神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、環磷酸腺苷（cAMP）、可卡因成癮、間隙連接、調節脂肪細胞中的脂肪分解、苯丙胺成癮、環磷酸鳥苷酸（cGMP）-環磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶（PKG）、內分泌抵抗、雌激素信號通路、Rap1、膽堿能突觸、腎素分泌等信號通路，詳見圖6。

圖3 生物過程GO富集氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO enrichment for biological process

圖4 分子功能GO富集氣泡圖Fig.4 Bubble chart of GO enrichment for molecular function

圖5 細胞組分GO富集氣泡圖Fig.5 Bubble chart of GO enrichment for cell components

圖6 KEGG通路富集氣泡圖Fig.6 Bubble chart of KEGG pathway

2.4 小建中湯核心成分-核心靶點-通路構建

使用Cytoscape 3.8.0軟件對前20條通路及其對應靶點和化合物進行分析，構建小建中湯治療抑郁癥對應核心成分-核心靶點-通路網絡示意圖，得到31個核心靶點，20條信號通路，31個核心成分。節點的度值越大，節點大小越大，顏色越深，詳見圖7。可見，荷葉堿（nuciferin）、可可堿［（S）-coclaurine］、左旋千金藤啶堿（stepholidine）等為小建中湯的有效成分，雌激素受體1（ESR1）及AKT1，AchE，MAO-B等為作用靶點，神經活性配體-受體相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）等為信號通路。

圖7 核心成分-核心靶點-通路網絡Fig.7 Core ingredients-core targets-pathway network

3 討論

本研究中，通過預測靶點基因、構建PPI及提取核心網絡，共篩選出AKT1，SLC6A4，APP，DRD2，MAO-A，CHRNA4，MAO-B，SLC6A3，AchE，CNR1等36個核心靶點。Akt1為磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）下游的關鍵靶點之一，重度抑郁癥自殺患者的腦組織中Akt蛋白活性明顯降低［17］。研究發現，Akt1的多態性與抑郁癥患者的抑郁嚴重程度顯著相關，與抑郁癥患者的焦慮癥狀、工作、活動、自殺傾向密切相關［18］。SLC6A3和SLC6A4分別為多巴胺和5-羥色胺（5-HT）的轉運蛋白，在調節對這些神經遞質的神經元反應中起重要作用［19］。研究發現，抗抑郁藥物通過停留在跨膜螺旋1，3，6，8，10間的中央結合位點而將SLC6A4鎖定為向外開放的構型，直接阻斷5-HT的結合［20］。SLC6A3敲除小鼠的抑郁癥動物模型實驗結果顯示，多巴胺轉運蛋白的活性對抑郁癥有顯著影響［21］。APP的過度表達導致β-淀粉樣肽的產生增加，進而抑制興奮性傳遞［22］。DRD2是多巴胺系統中的一個重要受體，是目前使用的多數抗精神病藥物的靶標［23］。有研究發現，大鼠腦深部內側前腦束刺激后表現出抗抑郁樣反應，同時DRD2表達增加［24］。MAO-A和MAO-B與抑郁癥密切相關，在單胺類神經遞質代謝中起關鍵作用，均為抗抑郁藥物單胺氧化酶抑制劑的藥理學作用靶點［25-26］。已有研究證明，β-細辛醚可減少小鼠腦內AChE的表達水平，且增加小鼠腦內的多巴胺表達水平，進而發揮抗抑郁作用［27］。CNR1與抑郁癥密切相關，其激動劑具有抗抑郁樣性質，并通過前額葉內側皮層調節5-HT的神經元活性［28］。

KEGG通路富集分析結果表明，小建中湯治療抑郁癥主要的通路為神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、鈣信號通路、多巴胺能突觸、cGMP-PKG信號通路等。其中，神經活性配體-受體相互作用信號通路涉及細胞質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體［29］。該通路涉及了血清素受體、多巴胺受體、腎上腺素受體等20個靶點。而該通路與抗精神病藥理學有關，這對于制訂改善精神分裂癥的治療策略至關重要［30］。研究表明，抑郁癥與5-HT受體及其功能有較大聯系，且5-HT1A，5-HT1B，5-HT1D，5-HT2A，5-HT2C，5-HT7等受體與抑郁癥關系密切［31］。快感缺乏癥被認為是抑郁癥的核心特征，而多巴胺系統在這種抑郁癥所描述的欣快感缺失中起著關鍵作用［32］。研究發現，抑郁癥與二價鈣離子的失調有關，其主要通過鈣信號傳導級聯發揮作用［33］。鈣信號通路刺激一氧化氮（NO）合成，進而誘導鳥苷酸環化酶將三磷酸鳥苷轉化為cGMP。另有研究表明，小檗堿通過NO-cGMPPKG細胞信號轉導通路發揮抗抑郁作用［34］。

綜上所述，小建中湯治療抑郁癥具有多靶點、多途徑、多通路的特點，多巴胺受體、轉運蛋白、AchE和MAO為小建中湯抗抑郁的主要候選靶點，其可能通過神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、鈣信號等通路發揮作用。