鹽脅迫下不同水稻品種苗期植物內源激素含量的變化特征

沈 泓，張 櫻，張 軒，姚棟萍,2,3，賀榮華，陳 哲，張 柳，柏 斌,3

（1. 湖南雜交水稻研究中心，雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙 410125；2. 湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128；3. 國家耐鹽堿水稻技術創新中心，湖南 長沙 410125；4. 湖南省永州市寧遠縣農業農村局，湖南 永州 425699）

土壤鹽漬化是一個全球性生態問題，也是當今世界耕地退化和土地荒漠化的主要原因之一。我國土壤鹽漬化具有面積大、分布廣、類型多的特點。據統計，我國鹽堿土壤面積達1億hm2，且呈不斷加重趨勢[1]。在不同的生長發育時期，水稻對土壤鹽堿的耐受程度不同，其中幼苗期對鹽脅迫最為敏感[2]。鹽堿地種稻是一項“寓改良于利用”的技術，不僅能有效利用鹽堿地提高糧食產量，而且可以通過水稻根系所分泌的有機酸減輕土壤的鹽堿化程度，起到土壤改良作用[3]。雖然目前已有海水稻等耐鹽水稻品種的相關報道，也有許多關于鹽脅迫對水稻種子萌發與幼苗根系生長影響及其作用機理的研究，但是植物激素對水稻耐鹽調控的相關研究尚不多見。

在鹽脅迫下水稻植株首先表現出各種生長發育過程受阻[4]，其危害機理通常為滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫[5]，而植株耐鹽生理調節機制主要包括滲透調節、養分調節、抗氧化調節和激素調節，其中植物內源激素發揮著重要的調節作用。研究表明，主要有3種內源激素參與水稻的鹽脅迫調控。一是水楊酸（Salicylic acid，SA）。鹽脅迫條件下，水楊酸可通過誘導抗氧化防御系統或增強抗氧化能力，緩解膜脂過氧化的傷害，并通過降低質膜通透性改善細胞的代謝，調控離子吸收與分布，緩解鹽脅迫的壓力[6-7]。二是脫落酸（Abscisic acid，ABA）。在鹽脅迫條件下，ABA可誘導植物滲透調節物質脯氨酸（Pro）大量積累，緩解鹽分過高造成的滲透脅迫和離子毒害，維持水分平衡[8]，并提高相關保護性酶的活性[9]，從而減輕植物的鹽害。三是茉莉酸（Jasmonic acid，JA）。該內源激素與ABA結構相似[10]，也是一種防衛信號分子，經信號轉導調控氣孔的閉合，以削弱蒸騰作用進而減少水分的散失[11]。

植物內源激素的含量很低，通常在10-6~10-9g之間[12]；且性質不穩定，易分解或對周圍環境和介質溫度敏感[13]；加之植物機體構成復雜，粗提液中往往含有大量基質，使得植物激素的測定分析容易受到干擾[14]。因此，檢測植物激素時，操作必須簡便、快速，儀器必須靈敏、專一。目前，植物激素主要采用色譜-質譜聯用技術測定，可分為氣相色譜-質譜聯用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-電噴霧-串聯質譜法（HPLC-ESI-MS/MS）。GC-MS雖然在靈敏度問題上能滿足植物激素的測定要求，但對樣品的純化要求很高，樣品需要進行衍生化處理，使樣品前處理步驟變得更加繁瑣[15]。而HPLC-MS/MS不僅具有靈敏度高和選擇性好的特點，且該方法不需要對樣品進行繁瑣的衍生化處理，操作步驟簡化，檢測效率較高，適用于熱穩定化合物、極性化合物等物質的測定。因此，普遍采用HPLC-MS/MS法測定植物激素[16]。但是目前有關鹽脅迫下植物激素含量變化的研究報道較少，且無法精準定量檢測植物內源激素含量變化。筆者改進了NY/T 2871—2015[17]中水稻植物激素的檢測方法，使檢測方法的準確度與精確度更高，以便更精準地分析植物內源激素含量的變化。研究比較了不同水稻品種在相同鹽脅迫下茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）3種植物激素含量的變化，初步探討了水稻耐鹽能力與植物激素的關聯性，從而明確對水稻耐鹽能力起關鍵作用的植物內源激素，為今后通過調節激素水平提高水稻耐鹽能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種有耐鹽品種超優千號、Y兩優900以及鹽敏感品種IR64，均由湖南雜交水稻研究中心 提供。

主要試驗試劑有Yoshida水稻營養液（Coolaber公司）、HPLC甲醇（Merck公司）、HPLC甲酸（科密 歐）、甲酸銨（Sigma-Aldrich）、純水（Waters蒸餾水）。茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）的標準品均來自sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

主要儀器設備有三重四極桿液相色譜-質譜聯用儀（SHIMADZU LCMS-8060）、C18色譜柱（Shim-pack GIST-HP 2.1 mm×50 mm，3 μm）、分析天平（Mettler toledo）、渦旋振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）、臺式超速冷凍離心機（德國Eppendorf）、移液槍（德國Eppendorf）、氮吹儀（上海錦文儀器設備有限公司）、混合型陰離子交換固相萃取柱（上海安譜實驗科技儀器有限公司）、超低溫冰箱（三洋冷鏈公司）、冰箱（青島海爾股份有限公司）、超純水設備（萊特萊德純水設備技術有限公司）、光照培養箱（韶關市廣智科技設備有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品溶液配制精確稱取各植物激素標準品適量，用甲醇溶解制成濃度為1000 μg/mL標準儲備液；分別吸取一定量的3種植物激素標準儲備液，用甲醇制成濃度為1 μg/mL的混合標準儲備液；分別吸取一定量的混合標準儲備液，用80%甲醇水制成濃度為0.5~100 μg/L的植物激素混合標準工作液。

1.2.2 水稻幼苗培養取3個品種的水稻種子各約200粒，在50℃烘箱中處理3 d后置于35℃、光照強度兩級的光照培養箱中浸泡至露白；待種子發芽后，放入96孔板，每孔放置一顆發芽種子，將96孔板放入盛有純水的托盤內，蓋上保鮮膜，置于光照培養箱培養；待幼苗的主根長至2~3 cm時（一般3~4 d），將托盤內的純水改為1/2 Yoshida培養液（pH值5.5），并轉移到人工氣候室進行培養；培養6 d后，將1/2培養液改為全培養液（pH值5.5）；注意每3 d更換一次培養液，并確保培養液體積不變。人工氣候室的培養條件：光照時間14 h，溫度（25±4）℃；黑暗時間10 h，溫度（20±2）℃；光照強度為240~350 μmol/(m2·s）；相對濕度為60%~70%。每個品種設置試驗組和對照組。

1.2.3 苗期鹽處理待幼苗長至3葉一心時更換新的全培養液，加入濃度0.8%的NaCl進行鹽處理。每周更換一次全培養液，并且重新加入相應濃度的鹽，確保鹽濃度的穩定。期間注意觀察水稻幼苗的形態變化，并拍照記錄。

1.2.4 樣品采集及前處理（1）樣品采集：分別采集鹽脅迫0（對照組）、6、24和72 h的水稻幼苗樣品，采樣時將莖葉與根分開，用錫箔紙包好，做好標記后于－80℃冰箱中避光保存。（2）樣品前處理：研缽預冷，將莖葉放入研缽中，加入液氮研磨，稱取0.1 g試樣（精確到0.1 mg）于2 mL塑料離心管中，加入1 mL預冷（4℃）的80%甲醇水，置于4℃冰箱中浸提16 h，期間振搖2~3次；取出，于4℃下13000 r/min離心15 min后，傾出上清液；往殘渣中再次加入1 mL 80%甲醇水，漩渦振蕩，按上述條件離心，合并2次提取液于10 mL容量瓶中，加入2 mL 80%甲醇水后用水稀釋至刻度線，混勻；移取4.00 mL上述提取液過混合性陰離子交換固相萃取柱（使用前需活化），依次用2 mL純水和2 mL甲醇淋洗，用2 mL 1%甲酸甲醇溶液洗脫2次，用5 mL離心管收集洗脫液，并于50℃下氮吹干，加水稀釋至0.5 mL，漩渦混勻，濾膜過濾，待測。

1.2.5 檢測方法優化（1）色譜條件：Shim-pack GIST-HP C18（2.1 mm×50 mm，3 μm）色譜柱；設置2種流動相A，一是5 mmol/L甲酸銨，二是5 mmol/L甲酸銨-0.02%甲酸溶液，考察哪種溶液更適合作為流動相A；流動相B為甲醇；流速0.4 mL/min；進樣體積5 μL；柱溫40℃；梯度洗脫程序0~6 min 20%~90% B、6~8 min 90% B、8~8.1 min 90%~20% B、8.1~13 min 20% B。（2）質譜條件：電噴霧離子源負離子模式（ESI-）；離子源接口電壓3.0 kV；離子源溫度300℃；脫溶劑管溫度526℃；加熱模塊溫度400℃；霧化氣為氮氣，3.0 L/min；干燥氣為氮氣，10.0 L/min；碰撞氣為氬氣；檢測方式為多反應監測（MRM）。優化后，3種植物激素的MRM參數見表1。

表1 優化后的MRM參數

1.2.6 方法學考察（1）線性關系、檢出限及定量限：將0.5、1、5、10、25、50和100 μg/L的系列混合標準溶液進行HPLC-MS測定，每個樣進3針，以濃度 （μg/L）為橫坐標、峰面積為縱坐標制作標準曲線，進行線性回歸分析；并通過信噪比S/N=3和S/N=10計算得出方法的檢出限（LOD）與定量限（LOQ）。（2）精密度：以5、50和100 μg/L這3種濃度水平的混合標準溶液在優化后的色譜-質譜條件下按順序連續進樣5次，通過計算3種植物激素的保留時間和峰面積的相對標準偏差（RSD，%）來衡量精密度。

2 結果與分析

2.1 同時測定3種植物激素的方法優化

與NY/T 2871—2015中的方法相比，該研究的優化在于：（1）將樣品減少為0.1 g，使用較小的離心管，讓提取液與樣品充分接觸；（2）將氮吹步驟的吹至“近干”改為“全干”，以改善誤差問題；（3）將原來的流動相A 5 mmol/L甲酸銨溶液改為5 mmol/L甲酸銨-0.02%甲酸溶液。如圖1所示，當以5 mmol/L甲酸銨溶液為流動相A時，SA、JA和ABA 3種植物激素的峰分離效果不佳，而以5 mmol/L甲酸銨-0.02%甲酸溶液為流動相A時，3種植物激素之間的分離度較好，各激素基線之間沒有重疊。由此表明，該檢測方法可同時進行SA、JA和ABA 3種植物激素的檢測。

圖1 采用不同流動相獲得的色譜圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系、檢出限及定量限從表2中可以看出，3種植物激素在所選的濃度范圍內與其峰面積都呈現出良好的線性關系，相關系數（R2）均大于0.999；該檢測方法的靈敏度較高，檢出限在0.02~0.08 μg/L之間，定量限在0.07~0.25 μg/L之間。

表2 3種植物激素的線性關系、檢出限和定量限

2.2.2 精密度由表3可知，3種植物激素的保留時間相對標準偏差在0.100%~0.194%之間，峰面積相對標 準偏差在0.286%~3.125%之間，表明儀器精密度較優。

表3 3種植物激素保留時間和峰面積的重復性結果（n=5）

2.3 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗的形態表現

3個供試水稻品種在不同鹽處理時間下的生長狀況如圖2所示。在鹽處理之前，耐鹽品種Y兩優900、超優千號與鹽敏感品種IR64的水稻苗期長勢不同，耐鹽品種株型挺拔，而鹽敏感品種葉片披散，株高相對矮小。經鹽處理6 h后，2個耐鹽品種并無明顯 變化，而IR64經鹽處理6 h后部分葉尖已經開始泛黃并出現輕微卷曲。經鹽處理24 h后，2個耐鹽品種的水稻葉片尚未出現明顯變化，而此時IR64的葉片明顯卷曲，且可較為清晰地看到葉尖部分的葉脈紋路顏色暗黃，表現出顯著的鹽脅迫特征。經鹽處理72 h后，2個耐鹽品種的葉尖部分泛黃，幼苗生長情況依舊良好；而此時IR64的葉片卷曲得更為嚴重，且泛黃明顯。

圖2 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗的形態變化

2.4 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗SA含量的變化

由圖3可知，3個水稻品種葉片中植物激素SA的含量變化趨勢不同，但在鹽脅迫下，SA的含量都有所增加，只是不同品種中SA含量出現上升的時間點不同。鹽敏感品種IR64的SA含量在鹽脅迫前為（383.85±63.79） ng/g；隨著鹽脅迫時間的延長，其含量變化呈現出先增加后降低，再增加的規律。耐鹽品種Y兩優900的SA含量在鹽脅迫前達到了（552.31±51.80） ng/g，高含量的SA可能與該品種的特殊耐鹽性有著一定的關系；隨著鹽脅迫時間的延長，其含量變化呈現出下降的趨勢，而在鹽脅迫72 h后又略微升高。另一耐鹽品種超優千號的SA含量在鹽脅迫前為（186.49±10.76） ng/g，在鹽脅迫24 h后，SA含量增加至（427.97±26.67） ng/g，在鹽脅迫72 h時開始出現輕微的下降。

圖3 鹽脅迫下3個水稻品種苗期SA含量的變化

2.5 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗JA含量的變化

由圖4可知，在鹽脅迫前，鹽敏感品種IR64的JA含量明顯高于另外2個耐鹽品種；鹽脅迫24 h時，JA的含量出現驟降；整體來看，隨著鹽脅迫時間的延長，JA含量變化呈現出先減少后增加的趨勢。相較于鹽敏感品種IR64，2個耐鹽品種的JA含量變化較為緩和，差異不顯著。Y兩優900品種的JA含量變化在鹽脅迫24 h內呈現出下降趨勢，而在72 h其含量又有所增加；而超優千號品種在鹽脅迫72 h內，JA含量一直呈現出逐漸下降的變化規律。

圖4 鹽脅迫下3個水稻品種苗期JA含量的變化

2.6 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗ABA含量的變化

由圖5可知，ABA作為一種逆境脅迫調控激素，在正常生理條件下其含量是極低的；但在經0.8%NaCl處理6 h后，ABA的含量顯著升高；但隨著鹽脅迫時間的延長，ABA含量均有所下降；且3個水稻品種葉片的ABA均表現出相同的變化規律，該變化規律與他人的研究結果也一致。此外，對比3個水稻品種在鹽脅迫24 h后ABA的含量可以發現：2個耐鹽品種的ABA含量下降恢復得較快，特別是Y兩優900，在鹽脅迫24 h后ABA的含量已降至（99.37±4.61） ng/g；而鹽敏感品種IR64的ABA含量相比之下恢復得較為緩慢。

圖5 鹽脅迫下3個水稻品種苗期ABA含量的變化

3 討 論

研究結果表明，脫落酸（ABA）在鹽脅迫中起著非常關鍵的作用，對于脅迫環境極其敏感。鹽脅迫初期ABA迅速積累，可使氣孔關閉，降低蒸騰速率，并通過啟動植物體內的各信號分子進行復雜的網絡調控，以緩解鹽脅迫造成的離子毒害和氧化損傷，尤其是滲透脅迫[18]，從而減少或避免鹽脅迫對植物生長的迫害，起到一定的保護作用。由于過多的ABA會抑制植物的生長，因此當水稻幼苗適應了這種環境脅迫后，ABA含量的降低，會讓植物恢復正常的代謝水平與生長狀態。

ABA作為植物激素響應脅迫的調控中心，同時還影響著其他植物激素的含量變化。3個水稻品種的JA含量在鹽脅迫前期均呈降低趨勢，原因尚不明確；但在鹽處理一段時間后，JA含量有所增加，原因可能是ABA的積累促進了茉莉酸信號通路阻遏蛋白JAZ（Jasmonate-ZIM-domain，JAZ）的泛素化降解[19]，從而釋放JA下游基因的表達，表現為茉莉酸含量的增加，使自身耐受性得到進一步的提高。與耐鹽品種不同的是，鹽敏感品種IR64本身就含有較高的茉莉酸（JA），這可能是由于不同品種之間存在理化特性差異所致。李天雪等[20]在測定不同鹽堿處理下金銀花幼苗JA含量時發現，鹽堿脅迫下JA含量會有所下降，在后期才會出現明顯增加。試驗中JA的含量變化規律與該研究相符。

研究改進了現行的植物激素檢測方法，提升了植物激素檢測的靈敏度和精確度，后期需通過內標法和衍生化處理，進一步提升植物激素前處理的回收率和檢測的穩定性。通過探討不同耐鹽能力的水稻品種鹽脅迫0、6、24和72 h下3種植物激素的含量變化，初步分析了3種植物內源激素含量變化規律以及激素間相互作用對水稻生長的影響，有助于解析植物激素參與水稻鹽脅迫調控的生理機制，為水稻耐鹽脅迫研究提供理論支撐。