鳥巢蕨孢子體試管外誘導(dǎo)與移栽基質(zhì)篩選

杜高齊，孟 靜，胡本湘，何 俊，許 彬

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201）

鳥巢蕨（Asplenium nidus），又名巢蕨、山蘇花、王冠蕨，為鐵角蕨科巢蕨屬多年生常綠蕨類植物[1]，株形奇特，葉色翠綠有光澤，是優(yōu)良的園林景觀植物、室內(nèi)盆栽植物、插花葉材料，市場需求很大[2]，有研究顯示其食用和藥用價(jià)值也很高[3]。

孢子繁殖是蕨類植物繁殖的重要方式[4]，具有取材少、繁殖系數(shù)大、成苗量大、擴(kuò)繁快速的優(yōu)點(diǎn)。然而，不同種蕨類植物的孢子繁殖具有一定差異，在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中難以一一掌握所有種類的孢子繁殖規(guī)律，因此這種繁殖方式不利于資源蕨類植物的高效率開發(fā)應(yīng)用。而原葉體誘導(dǎo)孢子體是蕨類植物繁殖的有效方 式[5]，對(duì)于一些無孢子或孢子量少、孢子不育的雜交種以及孢子繁殖困難的種類尤為適宜[6]。原葉體誘導(dǎo)孢子體主要有試管內(nèi)和試管外2種誘導(dǎo)方式，但是試管內(nèi)誘導(dǎo)孢子體較難，幾乎無孢子體產(chǎn)生。試管外誘導(dǎo)孢子體的研究中發(fā)現(xiàn)，不同誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果不同，1 g/L KH2PO4的誘導(dǎo)效果最佳[7-8]。

基質(zhì)主要通過營養(yǎng)供給、通氣狀況等影響蕨類植物的孢子萌發(fā)、配子體和孢子體的生長發(fā)育[9]。試管外誘導(dǎo)蕨類植物孢子體的基質(zhì)要求疏松透氣、保水保肥、不含有害物和雜草種子。王陽[5]發(fā)現(xiàn)在常規(guī)條件下以對(duì)開蕨0.5 cm原葉體進(jìn)行孢子體誘導(dǎo)試驗(yàn)，草炭是最適誘導(dǎo)基質(zhì)。趙玉安等[10]的研究表明，草炭與珍珠巖按體積比3∶1混合制成的基質(zhì)最適宜鳥巢蕨孢子體誘導(dǎo)。移栽基質(zhì)對(duì)鳥巢蕨孢子體種苗質(zhì)量有很較大影響。吳士彬等[11]的研究顯示，鳥巢蕨孢子體的最適移栽基質(zhì)為草炭、珍珠巖、蛭石按體積比3∶1∶1混合。

試驗(yàn)以鳥巢蕨組培原葉體為材料，研究不同直徑大小的原葉體塊以及不同基質(zhì)對(duì)鳥巢蕨試管外孢子體誘導(dǎo)的影響，并對(duì)移栽基質(zhì)進(jìn)行了篩選，旨在為鳥巢蕨工廠化育苗提供理論和技術(shù)支持，為其商業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以經(jīng)鳥巢蕨孢子無菌萌發(fā)、組織培養(yǎng)得到的原葉體為試驗(yàn)材料，于2018年11月至2019年3月在實(shí)驗(yàn)室和大棚中進(jìn)行孢子體誘導(dǎo)及栽培試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同大小原葉體塊誘導(dǎo)孢子體為探討原葉體塊大小對(duì)孢子體誘導(dǎo)效果的影響，根據(jù)原葉體切割直徑大小設(shè)3個(gè)處理（分別為2.0、1.0、0.5 cm），將原葉體塊插入以草炭為基質(zhì)的9 cm培養(yǎng)皿中；每個(gè)處理重復(fù)6次，原葉體直徑2.0 cm的處理每個(gè)培養(yǎng)皿種植5塊，共30塊；直徑1.0 cm的處理種10塊，共60塊；直徑0.5 cm的處理種20塊，共120塊；放入人工氣候箱中培養(yǎng)，濕度保持在80%以上，溫度保持在25℃，每2 d噴一次1 g/L KH2PO4。當(dāng)分化出孢子體時(shí)開始計(jì)數(shù)，每隔5 d統(tǒng)計(jì)一次誘導(dǎo)情況，40 d后培養(yǎng)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)孢子體誘導(dǎo)及壞死情況。

1.2.2 孢子體試管外誘導(dǎo)基質(zhì)篩選孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)配方設(shè)置7個(gè)處理，分別為：A1，草炭；A2，珍珠巖、椰糠按1∶1比例（體積比，下同）混合；A3 ，椰糠；A4，蛭石；A5，草炭、珍珠巖按1∶1比例混合；A6，草炭、蛭石按1∶1比例混合；A7，河沙。基質(zhì)用0.5 g/L的多菌靈溶液浸透消毒處理后備用。將原葉體洗凈切成1.0 cm的小塊，放入裝有基質(zhì)的9 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放10塊，每個(gè)處理重復(fù)5次，培養(yǎng)條件同上。當(dāng)分化出孢子體時(shí)開始計(jì)數(shù)，每隔5 d統(tǒng)計(jì)一次誘導(dǎo)情況，40 d后培養(yǎng)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)孢子體誘導(dǎo)及壞死情況，按公式（1）、（2）計(jì)算孢子體誘導(dǎo)率、壞死率。

1.2.3 移栽基質(zhì)篩選孢子體移栽基質(zhì)配方設(shè)置5個(gè)處理，分別為：B1，椰糠；B2，珍珠巖、草炭按1∶1比例混合；B3，草炭；B4，珍珠巖、椰糠 按1∶1比例混合；B5，草炭、蛭石、珍珠巖按2∶1∶1的比例混合。將誘導(dǎo)出孢子體的原葉體塊取出放入溫室中，5 d后移栽入消毒后的基質(zhì)（消毒處理同上）。移栽時(shí)將孢子體植株從原葉體上分離，洗凈，栽入帶有基質(zhì)的24孔穴盤中，放入育苗箱中保濕培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率；每個(gè)處理栽植10株，每個(gè)處理重復(fù)5次。成活后每個(gè)處理隨機(jī)選取10株測量孢子體株高、葉片數(shù)、平均葉面積（每株取最大葉片測面積）、冠幅（植株長×植株寬），每隔5 d統(tǒng)計(jì)一次，60 d培養(yǎng)結(jié)束。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

試驗(yàn)參考王春榮等[12]方法，根據(jù)葉片數(shù)、株高、冠幅、葉面積、成活率5個(gè)指標(biāo)在不同基質(zhì)中的表現(xiàn)將鳥巢蕨各項(xiàng)指標(biāo)排序，各項(xiàng)指標(biāo)的影響均設(shè)定為1，按排序進(jìn)行打分，規(guī)定第一名5分，第二名4分，依次類推，最后一名1分，再計(jì)算各處理總分值，進(jìn)行綜合評(píng)判，得分最高的基質(zhì)為最適基質(zhì)配比。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件和DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 原葉體塊直徑對(duì)鳥巢蕨孢子體誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)40 d后，不同直徑原葉體塊誘導(dǎo)的鳥巢蕨孢子體株數(shù)及壞死率如圖1所示，孢子體在試管外誘導(dǎo)時(shí)，3種直徑的原葉體塊均能誘導(dǎo)出孢子體，隨著原葉體塊直徑的增加，誘導(dǎo)效果顯著提升，但壞死率也隨之增加；直徑為2.0 cm的原葉體塊孢子體誘導(dǎo)株數(shù)最多，為106株，分別是直徑0.5、1.0 cm原葉體塊誘導(dǎo)株數(shù)的4.8、2.4倍；壞死率也最高，達(dá)到13.3%，分別比直徑0.5、1.0 cm原葉體塊壞死率高10.8、3.3個(gè)百分點(diǎn)。

圖1 不同直徑原葉體誘導(dǎo)的鳥巢蕨孢子體株數(shù)及壞死率

2.2 鳥巢蕨試管外孢子體誘導(dǎo)的最佳基質(zhì)

由表1可知，不同基質(zhì)誘導(dǎo)鳥巢蕨孢子體的效果差異較大，各處理孢子體誘導(dǎo)率大小趨勢為A1＞A5＞ A6＞A2＞A7＞A3＞A4。原葉體壞死率最高的基質(zhì)是A4，其次為A7；A1和A5沒有壞死情況發(fā)生。綜合誘導(dǎo)率和壞死率結(jié)果，認(rèn)為草炭（A1）為鳥巢蕨孢子體誘導(dǎo)的最佳基質(zhì)。

表1 不同基質(zhì)下鳥巢蕨孢子體的誘導(dǎo)情況

2.3 鳥巢蕨孢子體移栽的最佳基質(zhì)

如表2所示，鳥巢蕨孢子體移栽60 d后不同移栽基質(zhì)中植株生長情況有較大差異。各處理成活率由高到低排列依次為B2＞B1=B3＞B4＞B5。其中，B2處理成活率最高，達(dá)到100 %，B5處理最低，為83.30%。不同基質(zhì)對(duì)鳥巢蕨生長產(chǎn)生的影響不同，與其他處理相比，B2處理除葉片數(shù)少于B1處理外，其他4項(xiàng)指標(biāo)均為最大值，且與其他處理差異顯著。由表3可知，各處理綜合排序依次為B2＞B1＞B3＞B4＞B5，其中B2處理綜合排序第一，可見B2是最適合鳥巢蕨孢子體移栽的基質(zhì)配方。

表2 不同栽培基質(zhì)下鳥巢蕨的生長情況

表3 不同栽培基質(zhì)下各項(xiàng)指標(biāo)得分情況及綜合排序

3 討論與結(jié)論

蕨類植物原葉體發(fā)育形成孢子體的概率較低，曾漢元[13]對(duì)24種蕨類植物進(jìn)行孢子體誘導(dǎo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原葉體發(fā)育形成孢子體的誘導(dǎo)率為10%~70%。該試驗(yàn)使用鳥巢蕨原葉體誘導(dǎo)孢子體，誘導(dǎo)率與上述結(jié)果基本一致，平均誘導(dǎo)率為46%，但少有人研究原葉體直徑對(duì)孢子體誘導(dǎo)的影響。張善信等[14]將鳥巢蕨原葉體團(tuán)切割成0.5 cm直徑的團(tuán)塊進(jìn)行孢子體誘導(dǎo)；潘曉韻等[15]將鳥巢蕨原葉體切成0.5~1.0 cm的小塊作為材料；劉洋[8]采用0.5 cm的鳥巢蕨原葉體團(tuán)進(jìn)行孢子體誘導(dǎo)；劉聞川等[16]采用1.0 cm的槲蕨小段為材料進(jìn)行孢子體誘導(dǎo)；望雄英[17]則是以直徑1.0 cm的荷葉鐵線蕨原葉體團(tuán)為材料。而在該試驗(yàn)中，筆者將原葉體塊分為2.0、1.0、0.5 cm 3種直徑大小，探討其對(duì)孢子體誘導(dǎo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大塊原葉體（2.0 cm）更有利于孢子體誘導(dǎo)。

前人對(duì)孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)也進(jìn)行了相關(guān)的研究，顧德峰等[7]選用草炭作為對(duì)開蕨孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)；望雄英[17]發(fā)現(xiàn)泥炭與珍珠巖按6∶1比例混合制成的基質(zhì)中荷葉鐵線蕨孢子體誘導(dǎo)率最高，而該試驗(yàn)對(duì)7種不同的孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，草炭是最佳的鳥巢蕨孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)，誘導(dǎo)率最高為70.00 %，這與趙玉安等[10]報(bào)道的基本一致，分析其原因是草炭不僅可以提供孢子萌發(fā)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，也能夠?yàn)殒咦用劝l(fā)的環(huán)境提供充足的水分，同時(shí)也與原葉體直徑越大越有利于孢子體誘導(dǎo)有關(guān)。

蕨類植物需要良好的基質(zhì)為其提供足夠的養(yǎng)分、水分和支撐力，不同基質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)不同，因此選對(duì)基質(zhì)是栽培成功的關(guān)鍵。前人對(duì)鳥巢蕨栽培基質(zhì)進(jìn)行一系列的研究。例如：許澤康等[2]對(duì)經(jīng)過馴化的野生鳥巢蕨植株進(jìn)行移栽基質(zhì)篩選，發(fā)現(xiàn)椰糠是最適合鳥巢蕨人工栽培的基質(zhì)；陳金典[18]研究發(fā)現(xiàn)，鳥巢蕨組培苗的最適移栽基質(zhì)為草炭、珍珠巖與蛭石按3∶1∶1的比例混合或者鋸木屑、草炭與紅心土按1∶1∶1的比例混合。筆者設(shè)計(jì)了5種移栽基質(zhì)，最后發(fā)現(xiàn)，草炭與珍珠巖按1∶1比例混合而成的基質(zhì)綜合排序第1，這與與前人的研究結(jié)果不同，推測是因?yàn)樵诓萏恐屑尤胝渲閹r之后，改變了草炭的孔隙結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了透氣性，給鳥巢蕨孢子體提供了更適合的生長環(huán)境。

綜上所述，原葉體塊的直徑對(duì)孢子體誘導(dǎo)的影響較大，大塊原葉體（直徑2.0 cm）最有利于孢子體誘導(dǎo)；鳥巢蕨孢子體試管外誘導(dǎo)的最佳基質(zhì)為草炭，誘導(dǎo)率最高，達(dá)70.00%，無壞死情況發(fā)生；最適合鳥巢蕨孢子體移栽的基質(zhì)是珍珠巖與草炭按體積比1∶1混合而成的基質(zhì)，其成活率、冠幅、株高、葉面積方面均在所有處理中最高。該研究結(jié)果可為鳥巢蕨商業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。