中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白試劑性能驗證分析

孫江漫 李敏 邵燕 孟祥兆 陳寶榮 于洪遠

作者單位：1 北京航天總醫院檢驗科，北京 100076

2 北京金域醫學檢驗實驗室有限公司，北京 100015

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（Neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是一種小分子蛋白，由Kjeldsen 等[1]首次在中性粒細胞中發現，其位于染色體9q34 上，分子量25kD，屬于脂鈣蛋白家族。正常情況下，NGAL 在成熟外周血中性粒細胞和人體組織器官中的mRNA 表達較低。但在各種原因如腎毒性藥物、造影劑、感染、心臟病、重大手術、糖尿病等[2]導致的急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）早期，血液、尿液中的NGAL 濃度顯著升高，且與傳統腎功能檢測指標如血肌酐、血尿素氮、尿量等相比，NGAL 是一種更靈敏、更理想的早期腎功能損傷檢測指標。因此，血液和（或）尿液中NGAL 濃度升高對AKI 的診斷、治療和預后有重要的臨床意義[3]。本研究通過對市售的NGAL試劑盒參數進行分析研究后最終選取兩種試劑盒進行性能驗證，并比較其不同檢測系統結果的一致性，為NGAL 的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本20 份無溶血、黃疸、乳糜的臨床剩余單人份血清樣本，衛健委質控品（202011～202015）。

1.2 儀器日立7170 自動生化分析儀。

1.3 試劑邁克試劑檢測原理是膠乳免疫比濁，試劑批號0819021，校準品批號0819021，質控品批號0619021；生之源試劑檢測原理為膠乳增強免疫透射比濁，試劑批號19111458-A1，校準品批號20190808，質控品批號20190808。

1.4 方法檢測前對儀器進行日常清洗、常規維護和保養。按照各試劑盒說明書在日立7170 自動生化分析儀上設置參數，通過常規方法對儀器和試劑進行校準，質控在控進行下一步驗證。

1.4.1 正確度 目前國內外尚無NGAL 參考方法和標準物質，故通過檢測衛健委質控品（202011～202015）評價兩種試劑檢測結果的正確度；再使用兩種試劑同時檢測20 份單人份血清樣本，對檢測結果進行配對t檢驗，以評估兩種試劑檢測結果的一致性。

1.4.2 精密度 參考行標WS/T 420-2013，檢測2 個濃度水平（其中水平1 為正常值、水平2 為異常值）的患者血清樣本及試劑自帶高低值質控品，計算精密度是否符合試劑說明書的精密度要求，邁克試劑批內精密度要求≤8%，實驗室不精密度≤10%；生之源試劑批內精密度要求≤5%，實驗室不精密度≤10%。

1.4.3 線性 采用高低值血清樣本評估線性，按照6H∶0L、5H∶1L、4H∶2L、3H∶3L、2H∶4L、1H∶5L、0H∶6L方式配置7 個濃度梯度。邁克試劑要求濃度在25～5 000ng/ml，相關系數r≥0.99，其中25～200ng/ml時偏差應在±20ng/ml 內；200～5 000ng/ml 時偏差在±10%范圍內；生之源試劑要求濃度為25～3 000 ng/ml，相關系數r≥0.99，其中濃度為25～400ng/ml 時偏差應在±40ng/ml，400～3000ng/ml 時偏差在±10%范圍內。

1.5 統計學分析使用SPSS 20.0 軟件對數據進行分析，兩種試劑的正確度結果進行配對t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種試劑正確度驗證通過衛健委質控品檢測可知，生之源試劑的檢測結果與靶值的相對偏倚除最大值外均比邁克試劑大；邁克試劑除最大值外相對偏倚均在15%以內，而生之源試劑除最大值外均高于20%，但兩種試劑均未超出衛健委統計結果的允許范圍。見表1。

表1 衛健委質控檢測兩種試劑結果

2.2 兩種試劑對患者樣本的檢測結果兩種試劑的20 份單人份血清樣本檢測結果相比，差異有統計學意義（P=0.012）。兩種試劑的檢測結果有一定的偏差，但兩種試劑的相對偏倚均小于衛健委統計的最大偏倚（30%）。見表2。

表2 兩種試劑對20 份患者樣本的檢測結果（ng/ml）

2.3 兩種試劑精密度驗證在水平1、水平2、低值質控、高值質控上，邁克試劑批內精密度優于生之源試劑，而生之源試劑的實驗室內不精密度優于邁克試劑；兩種試劑高值精密度均比低值精密度高。但兩種試劑測量的精密度均在各自要求的范圍內。見表3。

表3 兩種試劑精密度對比（%）

2.4 兩種試劑線性驗證邁克試劑線性驗證結果示實測值與理論值無離群值，符合試劑說明書要求：濃度25～200ng/ml 時，偏差±20ng/ml；200～5 000ng/ml時偏差均在±10%內，見表4；相關方程y=1.02064x-68.66716，線性相關性良好（R2=0.99896），見圖1。生之源試劑驗證結果符合試劑說明書要求：濃度25～400ng/ml 時偏差±40ng/ml；400～3 000ng/ml 時，偏差在±10%內，見表5；相關方程y=0.99833x-14.0747，線性相關性良好（R2=0.99926)，見圖2。

圖2 生之源試劑線性驗證

表5 生之源試劑線性驗證結果

圖1 邁克試劑線性驗證

表4 邁克試劑線性驗證結果

3 討論

AKI 是各種嚴重疾病中最常見的并發癥之一，因此早期診斷對AKI 的治療至關重要。經典的AKI生化指標在腎功能發生不可逆損傷前不會發生明顯改變，這增加了AKI 早期識別的難度，導致患者死亡率增加。AKI 患者血液和（或）尿液中NGAL 的表達明顯升高，尤其是尿液中NGAL 水平與腎損傷嚴重程度密切相關，故NGAL 成為目前最有潛力的AKI 早期生化標志物。此外臨床檢測的準確性和可靠性是疾病診斷的基礎。

如何保障臨床實驗室檢測系統測量結果的準確性、可靠性是檢驗醫學研究的重點，也是臨床實驗室質量管理的核心。量值溯源是目前實現各檢測系統檢測結果準確可靠的一種常規方法，量值溯源是指溯源至該檢測項目的參考方法和標準物質[4]。基于目前國內外尚無NGAL 參考方法和標準物質，故通過衛健委質控品和20 份單人份血清樣本評估兩種試劑檢測結果的正確度和一致性。兩種試劑通過檢測衛健委質控品可知邁克試劑檢測結果的相對偏倚較生之源試劑小，但都在衛健委統計的允許范圍內。兩種試劑檢測20 份同一單人份血清樣本的結果有顯著性差異，說明兩種試劑檢測結果還是有一定的偏差。因為NGAL 尚無參考方法和標準物質，各試劑廠商就無法實現量值溯源[5]，導致各試劑檢測結果無法標準化，所以檢測結果會有偏差，衛健委的統計結果范圍也較大。所以即使兩種試劑檢測結果有偏差但也均在衛健委統計范圍內，另外邁克試劑的正確度略優于生之源試劑。對于精密度，邁克試劑批內精密度優于生之源試劑，而生之源試劑的實驗室內不精密度優于邁克試劑，但都在其要求的范圍內，均滿足臨床要求。兩者的線性相關性良好，均符合其說明書規范。

綜上所述，各試劑的性能良好，只是因為缺乏可溯源的途徑導致正確度有一定差異，故我們需要盡快研究NGAL 的參考方法或標準物質來驗證其檢驗結果的一致性和可比性，為臨床提供更準確的結果，以便于疾病的診斷和治療。