miR-602、miR-452表達與肝癌術后復發轉移及預后的關系研究

靖潔

作者單位：佳木斯市中心醫院消化內科，黑龍江 佳木斯 154002

肝癌是一種源自肝上皮組織或間葉組織的惡性腫瘤，發病率位于我國惡性腫瘤第3 位，病死率位于我國惡性腫瘤第2 位[1～3]。肝癌細胞生長活躍，易侵襲包膜和血管，出現局部擴散及遠處轉移，復發率高，化療耐藥性強，患者預后較差[4～6]，因此早期評估肝癌術后復發轉移情況是改善患者預后生存的關鍵。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類小型單鏈RNA 分子，具有高度保守、內源性及非編碼的特點，長度為18～24 個核苷酸，在多個蛋白編碼基因表達環節中有著重要的調控作用，可參與調控癌細胞增殖、分化、凋亡、轉移及腫瘤血管生成等生物學過程[7～9]。miR-602、miR-452 為近期發現的miRNA，在胃癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌等實體惡性腫瘤中表達異常[10，11]，但其與肝癌的關系尚不明確。因此，本研究檢測miR-602、miR-452 在肝癌組織及癌旁正常組織中表達情況并分析其差異性，探討miR-602、miR-452表達與肝癌術后復發轉移及預后的關系，以期為臨床診治肝癌提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料經本院倫理委員會批準，選取2014年12月～2018年12月在我院確診并行手術切除（R0 切除）的原發性肝癌患者72 例，術中收集癌組織及癌旁正常組織。入選標準：①患者經術后病理學檢查確診，術前和術中探查均未見遠處轉移；②入院之前均未接受治療的初診患者；③病歷資料完整；④簽署知情同意書。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②依從性差；③合并心、肺、腎、腦等重要臟器疾病；④合并精神系統疾病。72 例肝癌患者中男54 例，女18 例；年齡30～78 歲，平均（58.82±6.49）歲；腫瘤直徑：＜5cm 33 例，≥5cm 39 例；分化程度：高分化45 例，中低分化27 例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期50例，Ⅲ期22 例。

1.2 研究方法

1.2.1 RT-PCR 法 用總RNA 提取試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司）提取所有患者癌組織及癌旁正常組織中的總RNA，用反轉錄試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）將其反轉錄成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR 擴增。PCR 擴增體系（總25μl）：cDNA 模板2.0μl，RNase H2O 9.5μl，SYBR Primix Ex Taq 12.5μl，Primer 1.0μl。PCR 反應條件：95℃預變性5min，93℃變性10s，61℃退火延伸30s，40 次循環。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析，以2-△△Ct計算標準化后的miR-602、miR-452 表達水平，其中Ct 為循環閾值，內參為GAPDH。

1.2.2 隨訪情況 采用電話及門診檢查相結合的方式進行隨訪，隨訪內容包括超聲、CT、MRI、肝動脈造影等檢查。術后第1年每3 個月隨訪1 次，第2年開始每6 個月隨訪1 次，隨訪2年。記錄患者隨訪期間復發與轉移、存活情況。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗和Log-rank檢驗；采用Spearman 檢驗分析miR-602、miR-452 與肝癌術后復發轉移的相關性，ROC 曲線分析miR-602、miR-452 預測肝癌術后復發轉移的價值，COX 回歸模型及Kaplan-Meier 法分析miR-602、miR-452表達與肝癌術后預后的關系。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織及癌旁正常組織中miR-602、miR-452相對表達量miR-602、miR-452 在肝癌組織中的相對表達量較癌旁正常組織顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 肝癌組織及癌旁正常組織中miR-602、miR-452相對表達量（±s）

表1 肝癌組織及癌旁正常組織中miR-602、miR-452相對表達量（±s）

組織nmiR-602miR-452癌旁正常組織720.76±0.160.45±0.07肝癌組織723.76±1.203.15±0.98 t 21.02723.318 P＜0.001＜0.001

2.2 未發生和發生復發轉移患者miR-602、miR-452相對表達量72 例患者術后隨訪2年，失訪8 例，其中未發生復發轉移患者25 例，發生復發轉移患者39 例。發生復發轉移患者miR-602、miR-452相對表達量較未發生復發轉移患者顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.001），見表2。

表2 未發生和發生復發轉移患者miR-602、miR-452相對表達量（±s）

表2 未發生和發生復發轉移患者miR-602、miR-452相對表達量（±s）

復發轉移nmiR-602miR-452未發生251.02±0.780.76±0.64發生394.12±1.473.77±1.15 t-10.978-13.422 P＜0.001＜0.001

2.3 Spearman 相關性分析miR-602、miR-452 均與肝癌術后復發轉移呈正相關（r=0.501、0.548，P＜0.001）。

2.4 ROC 曲線分析miR-602、miR-452 單獨預測肝癌術后復發轉移的價值差異無統計學意義（P＞0.05）；兩個指標聯合預測肝癌術后復發轉移的價值明顯優于各指標單獨預測（P＜0.05），見表3、圖1。

表3 miR-602、miR-452 預測肝癌術后復發轉移的價值

圖1 miR-602、miR-452 預測肝癌術后復發轉移的ROC 曲線

2.5 單因素和多因素COX 回歸分析72 例患者術后隨訪2年，失訪8 例，其中生存48 例，死亡16 例。COX 回歸分析顯示，臨床分期及miR-602、miR-452表達上調是肝癌術后預后的影響因素（P＜0.05），見表4。

表4 單因素和多因素COX 回歸分析肝癌術后預后影響因素

2.6 Kaplan-Meier 生存曲線分析miR-602 相對表達量＞3.51 患者肝癌術后2年病死率（31.23%）顯著高于miR-602 相對表達量≤3.51 患者（7.02%），Log-rank（χ2）=2.436，P=0.038。miR-452 相對表達量＞2.01 患者肝癌術后2年病死率（29.65%）顯著高于miR-452 相對表達量≤2.01 患者（10.15%），Log-rank（χ2）=3.321，P=0.017。見圖2。

圖2 不同miR-602、miR-452 表達水平患者生存曲線

3 討論

病毒性肝炎、酒精、尼古丁、黃曲霉素污染、有機氯農藥、亞硝胺類物質等為肝癌的危險因素，臨床中以食欲下降、消瘦乏力、餐后上腹飽脹及肝區疼痛為主要表現[12]。隨著人們生活及飲食方式的改變，肝癌發病率及死亡率呈較為明顯的增高趨勢[3]。手術治療的進步及放療、化療、分子靶向治療的不斷發展，使肝癌患者生存時間有所延長，但術后復發轉移仍是臨床治療的難點問題[13]。因此，探究與肝癌發病及其進展有關的生物標志物具有重要意義。

miRNA 調控人體中1/3 左右的基因，在多種惡性腫瘤發病過程中具有關鍵作用，其與mRNA的非翻譯區結合，完全配對時可裂解mRNA，不完全配對時則可抑制mRNA 翻譯，引起相應調控蛋白質表達減少，導致疾病發生[14～16]。miRNA 可為促癌分子或抑癌分子，不同的miRNA 在相同或不同腫瘤中發揮著不同的效應[17]。研究發現[18～20]，miR-452 表達下調在膠質瘤中能促進腫瘤細胞干性特征以及腫瘤形成；miR-452 敲減后乳腺癌細胞化療耐藥性顯著增加；miR-452 可靶向調控生存素（Survivin）表達來阻礙非小細胞肺癌上皮-間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，最終抑制癌細胞轉移。上述研究提示miR-452 在膠質瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌中發揮抑癌效應。本研究結果顯示，miR-452 在肝癌組織中呈高表達，并與肝癌術后復發轉移及預后不良呈正相關，提示miR-452 在肝癌中可能發揮促癌效應，其促癌作用與以往的研究報道[21，22]相似，即miR-452 能夠靶向下調糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）水平，將無翅型MMTV 整合位點家族成員蛋白（Wnt）/β-連環蛋白（β-catenin）通路激活，造成胃癌細胞EMT；miR-452 在腎透明細胞癌患者癌組織中的表達量較癌旁正常組織增加約4 倍，它可能作為促癌基因參與了該疾病的發生。miR-602 為新發現的miRNA 之一，與細胞周期阻滯、血管生成及腫瘤形成等密切相關，miR-602在膽管癌中表達上調，可使該腫瘤細胞對化療藥物如卡培他濱、環磷酰胺等產生敏感性[23]。本研究中，miR-602 在肝癌組織中的相對表達量較癌旁正常組織顯著增加，提示miR-602 在肝癌組織中呈高表達，可能參與了肝癌的發生，與既往研究一致[24]，即乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）相關性肝癌患者癌組織中miR-602 表達較正常肝臟組織明顯上調，其表達量超過正常肝臟組織的2 倍以上，miR-602在HBV 感染至肝癌進程中具有重要作用。

此外，本研究顯示發生復發轉移患者miR-602、miR-452 相對表達量較未發生復發轉移患者顯著增加，Spearman 相關性檢驗顯示miR-602、miR-452 與肝癌術后復發轉移呈正相關。同時，COX 回歸分析顯示除臨床分期外，miR-602、miR-452 表達上調也是肝癌術后預后的影響因素；Kaplan-Meier分析顯示miR-602、miR-452 表達上調患者術后2年病死率顯著升高，提示miR-602、miR-452 與肝癌術后不良預后關系密切，miR-602、miR-452 對肝癌術后復發轉移及不良預后具有一定的預測作用。其機制可能為miR-602 靶向調控Ras 相關區域家族1A（Ras related region family 1A，RASSF1A）/Janus激酶（Janus kinase，JAK）通路，進而促進肝癌術后復發。ROC 曲線分析顯示，miR-602、miR-452聯合預測肝癌術后復發轉移的AUC 為0.900，敏感性為92.35%，特異性為88.10%，提示miR-602＞3.51且miR-452＞2.01 時肝癌術后復發轉移的風險性較大，兩者聯合檢測對于肝癌患者術后復發轉移的預測有較高的臨床應用價值。

綜上所述，miR-602、miR-452 在肝癌組織中呈高表達，與肝癌術后復發轉移及預后關系密切，有望成為肝癌術后復發轉移、不良預后評估的候選臨床標志物。但本研究樣本量不足，隨訪觀察時間較短，且miR-602、miR-452 與肝癌之間的作用機制尚不明確，仍有待進一步研究。